一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的方法
【專利摘要】本發明公開了一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的方法，通過親本的選取、精子的遺傳滅活、雌核發育四倍體魚苗的誘導，冷休克處理的方法獲得了雌核發育四倍體魚苗。本方法獲得雌核發育四倍體泥鰍的受精率、孵化率和成活率最高可達：76.99±2.51%、54.54±1.87%、17.9±0.65%；本發明具有先進、高效、實用、可靠的特點，在泥鰍育種上具有重大的應用價值和廣闊的應用前景。
【專利說明】一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于異源精子誘導泥鰍雌核發育領域，具體涉及一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的方法。
【背景技術】
[0002]雌核發育是魚類單性生殖中的一種重要的生殖方式，即用遺傳失活的精子去激活成熟的卵子發育，精子進入卵后不進行雄核與卵核融合，只起到激活卵子開始發育的作用，然后誘導雌核二倍化得到基因純合型魚。人工雌核發育在魚類純系的快速建立、性別決定和性別的人為控制以及基因圖譜的建立等方面都有十分重要的意義。一次人工誘導雌核發育的純度約相當于14個世代全同胞交配選育的結果，任何魚類經過連續兩次雌核發育就可以作為純系親本用于育種生產（Chen等，2009)。因此，人工雌核發育成為魚類遺傳育種工程中的一個熱點。
[0003]泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus)是我國常見的小型淡水魚類,其肉質細嫩、味美，營養豐富，且具有較高的藥用價值，被譽為“水中人參”。近年來，泥鰍的市場需求量日益增加，然而，由于多年的過度捕撈，加上天然水域生態環境日益惡化，我國野生泥鰍的資源量正面臨枯竭的危險。自上世紀90年代開始，泥鰍的繁育和養殖業在我國逐步得到發展，目前，已成為我國重要的水產經濟魚類。泥鰍作為我國新興起的一種小型經濟魚類，具有廣闊的發展前景。因此，泥鰍的遺傳育種研究具有重要的經濟意義。
[0004]已有的研究結果表明，泥鰍的染色體存在廣泛的核型多態性，我國的野生泥鰍群體中不僅存在二倍體；在長江流域，研究人員還發現有大量四倍體的存在。四倍體泥鰍的體型明顯大于二倍體，具有顯著性的生長優勢。四倍體泥鰍是我國特有的種質資源，為泥鰍的育種及相關領域的研究提供了理想的原材料。然而，目前利用天然四倍體泥鰍進行的雌核發育研究主要集中在日本， 并且這些研究幾乎都是采用紫外線滅活同源精子，然后激活卵子的方法來展開的。盡管研究人員對雌核發育關鍵技術(精子染色體的遺傳滅活以及卵子染色體的二倍化）條件的摸索和方法的優化做了大量的工作，但是雌核發育技術還存在雌核發育魚存活率低的問題，并且對雌核發育魚的鑒定比較復雜。
[0005]已有實驗證明遠緣激活源不僅能提高雌核發育魚的成活率，還能極大簡化雌核發育魚的鑒定問題。因為即使精子遺傳物質不能被全部滅活，雜交的后代也不會成活，能存活的個體也很容易與母本區別開。團頭鮮（Megalobrama amblycephala)精子就是一種誘導魚類雌核發育較好的遠緣激活源。利用團頭魴精子誘導天然四倍體泥鰍的卵子雌核發育，并進行染色體操作的研究，目前還未見報道。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供了一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的誘導方法，方法簡單，易行，利用本發明的方法，其受精率，孵化率和存活率均有很大的提高。
[0007]為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：[0008]一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的誘導方法，其步驟如下：
[0009]A、親本的選取與人工催產
[0010]選擇體形正常、外表無傷、體質健壯、腹部膨大有彈性、卵巢輪廓明顯的四倍體雌性泥鰍。雄性團頭魴要求胸鰭珠星明顯、有粗糙感、輕壓腹部有白色精液從生殖孔流出。
[0011]B、精子的遺傳滅活
[0012] 采集團頭魴精子，鏡檢選取活力在90%以上的用于紫外線滅活，團頭魴精液1ml，用Hank’ s溶液按照1:4體積比稀釋，置于經預冷的干燥培養皿(直徑75mm)中，精液厚度約為O. 1-0. 2mm，然后置于2支15W紫外燈下處理。燈管與靜液面距離10_12mm，滅活時間20-25min，精子的活力水平下降到30%時，停止光照。處理過的精液置于4°C冰箱中，避光保
存備用。
[0013]C、團頭魴精子誘導泥鰍雌核發育
[0014]將稀釋的精液200-600 μ L加入到含5_30ml四倍體泥鰍未受精卵的瓷盆中，混合均勻，隨后加入5-10ml7% (w/v)生理鹽水，繼續混勻后，加入50-200ml曝氣水。
[0015]D、冷休克處理：
[0016]采用0-4 V冰水混合物在授精后2-10min進行冷休克處理，處理持續時間20_55mino
[0017]最佳的冷處理條件為：0-4°C冰水混合物在授精后7-8min進行冷休克處理，處理持續時間30min。
[0018]F.孵化
[0019]受精卵經冷休克處理后，轉移至23°C的水浴中復溫。最后在曝氣水中孵化。
[0020]所述的曝氣水為水溫23-25°C，溶氧6. 0-7. Omg/L, pH值在?· 8-8. 2的自來水。
[0021]采用以下兩種方法進行泥鰍雌核發育四倍體魚苗的鑒定：
[0022]Α、流失分析和染色體分析鑒定雌核發育四倍體魚苗
[0023]選取15日齡魚苗，經MS-222麻醉后，剪斷分成兩部分，一部分用95%乙醇保存，另一部分在裝300μ I PBS的組織勻漿器中碾碎后，經200目尼龍網過濾，收集細胞懸液SOOr/min離心6min，棄去上清液，用DAPI染液染色5min后上流式細胞儀檢測，用已知二倍體泥鰍作為參照，雌核發育子代DNA含量約為二倍體泥鰍的2倍。用常規染色體制片的方法，對雌核發育四倍體子代進行染色體分析，發現雌核發育仔魚染色體數目為100條，與普通四倍體泥鰍的染色體數目相同，由此充分證明這些魚苗為四倍體個體。
[0024]B、微衛星分析鑒定雌核發育四倍體魚苗
[0025]粗鹽法提取親本和已檢測倍性雌核發育魚苗的總DNA，微量紫外分光光度計(NanoDr op2000)檢測DNA濃度和純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量。用已檢測出的多態性好、“父本”和母本特異性高的引物，來檢測雌核發育魚苗的遺傳組成。通過聚合酶鏈反應（PCR)，所得產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后凝膠成像系統照相。結果顯示，雌核發育魚苗中沒有出現“父本”的基因型，子代的遺傳物質來均自于母本。
[0026]與現有技術相比，本發明的優點為：
[0027]本發明建立的人工催產和雌核發育四倍體魚苗的誘導技術，技術先進，操作方便，方法高效、實用、可靠，利用本發明所述方法，最后四倍體雌核的受精率70-80%，孵化率30-60%，成活率7-12%。而且還極大簡化雌核發育魚的鑒定問題。采用遠源激活源，即使精子遺傳物質不能全部被滅活，雜交的后代也不會成活，能存活也會很容易與母本相區別出來。為泥鰍苗種生產和全雌四倍體苗種的研制提供了技術手段，在泥鰍規模化育苗、性別控制和全雌四倍體魚苗培育上具有重要的應用價值和廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖I為一種普通四倍體、雜交個體和未加倍處理的雌核發育個體形態特征示意圖。
[0029]a.普通個體：四倍體泥鰍的精子稀釋液與四倍體泥鰍的卵子進行授精；
[0030]b.雜交個體：未滅活的團頭魴精子稀釋液與四倍體泥鰍的卵直接授精；
[0031]c.未加倍處理的雌核發育個體：滅活的團頭魴精子稀釋液與四倍體泥鰍的卵授精，不進行冷休克處理。
[0032]圖2為一種不同冷休克處理持續時間處理后的受精率示意圖。
[0033]采用0-4°C冰水混合物進行冷休克處理，起始時間為受精后7min，8個冷休克處理的持續時間：20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min,處理結束后迅速置于
23± I °C的曝氣水中復溫，并繼續孵化。
[0034]圖3為一種利用流失細胞術檢測雌核發育四倍體魚苗的DNA相對含量示意圖。
[0035]圖4-1為一種泥鰍雌核發育魚苗的形態學特征示意圖。
[0036]圖4-2為一種染色體計數法分析鑒定雌核發育四倍體魚苗的染色體數目示意圖。
[0037]圖5為一種微衛星在雌核發育子代及其親本中的擴增電泳結果示意圖。
[0038]圖5-1為微衛星引物ESTllO在雌核發育子代的擴增電泳結果；
[0039]圖5-2為Mac589微衛星引物在雌核發育子代的擴增電泳結果；
[0040]圖5-3為EST851微衛星引物在雌核發育子代的擴增電泳結果；
[0041]I為父本；2為母本;M.標準分子量，PUC18 ;3_18.為泥鰍雌核發育子代。
【具體實施方式】
[0042]實施例I :
[0043]一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的誘導方法，其步驟如下：
[0044]A、親本的選取與人工催產
[0045]選擇體形正常、外表無傷、體質健壯、腹部膨大有彈性、卵巢輪廓明顯的四倍體雌性泥鰍。雄性團頭魴要求胸鰭珠星明顯、有粗糙感、輕壓腹部有白色精液從生殖孔流出。
[0046]B、精子的遺傳滅活
[0047]采集團頭魴精子，鏡檢選取活力在90%以上的用于紫外線滅活，取團頭魴精液Iml,用Hank’s溶液按照1:4體積比稀釋,置于經預冷的干燥培養皿(直徑75mm)中，精液厚度約為O. I或O. 15或O. 2mm，然后置于2支15W紫外燈下處理。燈管與靜液面距離10或11或12mm，滅活時間20-25min，滅活過程中持續輕搖培養皿使精液能夠被均勻照射，每隔30s取少量精液，用純水激活，在顯微鏡下觀察精子的活力，精子的活力水平下降到30%時，即可停止照射。處理過的精液置于4°C冰箱中，避光保存備用。
[0048]所述的Hank’ s 溶液的配方為：KC10. 40g, NaC18. 00g, NaHCO3O. 35g, KH2PO40.06g, NB2HPO4 ·7Η200· 09g, Na2HPO4 · 12Η200· IOg, MgSO4 ·7Η200· IOg, MgCl2 ·6Η200· 10g, CaCl2O. 14g和葡糖糖(Glucose) 1.0Og, ddH20 至 1000ml。
[0049]C、團頭魴精子誘導泥鰍雌核發育
[0050]將稀釋的精液200或400或600 μ L加入到5或17或30ml四倍體泥鰍未受精卵的瓷盆中，然后輕搖瓷盆使精卵混合均勻，隨后加入5或7. 5或10ml7%生理鹽水，繼續混勻后，加入50或100或200ml曝氣水。
[0051]D、冷休克處理：
[0052]采用0-4°C冰水混合物在授精后2或4或6或8或IOmin進行冷休克處理，處理持續時間20或30或40或55min。
[0053]F.孵化
[0054]受精卵經冷休克處理后，轉移至23°C的水浴中復溫。最后在曝氣水中孵化。
[0055]所述的曝氣水為水溫23-25°C，溶氧6. 0-7. Omg/L, pH值在8. O左右的自來水。
[0056]獲得的存活魚苗，經鑒定后全為四倍體魚苗，受精率70-80%，孵化率30-60%，成活率 7-12%。
[0057]最佳冷處理條件為：0-4°C冰水混合物在授精后7-8min進行冷休克處理，處理持續時間30min。
[0058]實施例2 ：
[0059]一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的誘導方法，其步驟如下：
[0060]A、親本的選取與人工催產
[0061]選擇體形正常、外表無傷、體質健壯、腹部膨大有彈性、卵巢輪廓明顯的四倍體雌性泥鰍。雄性團頭魴要求胸鰭珠星明顯、有粗糙感、輕壓腹部有白色精液從生殖孔流出。
[0062]B、精子的遺傳滅活
[0063]采集團頭魴精子，鏡檢選取活力在90%以上的用于紫外線滅活，取上述處理過的團頭魴精液1ml，用Hank’ s溶液按照1:4體積比稀釋，置于經預冷的干燥培養皿(直徑75mm)中，精液厚度約為O. 15mm，然后置于2支15W紫外燈下處理。燈管與靜液面距離12mm，滅活時間25min，滅活過程中持續輕搖培養皿使精液能夠被均勻照射，每隔30s取少量精液，用純水激活，在顯微鏡下觀察精子的活力，精子的活力水平下降到30%時，即可停止光照。處理過的精液置于4°C冰箱中，避光保存備用。
[0064]C、團頭魴精子誘導泥鰍雌核發育
[0065]將稀釋的精液400 μ L加入到含20ml四倍體泥鰍未受精卵的瓷盆中，然后輕搖瓷盆使精卵混合均勻，隨后加入20ml7% (w/v)生理鹽水,繼續混勻后,加入200ml曝氣水。
[0066]D、冷休克處理：
[0067]采用0-4°C冰水混合物在授精后7min進行冷休克處理，處理持續時間20_55min。
[0068]F.孵化
[0069]受精卵經冷休克處理后，轉移至23°C的水浴中復溫。最后在曝氣水中孵化。
[0070]所述的曝氣水水溫23-25°C，溶氧6. 0-7. Omg/L, pH值在?· 8-8. 2的自來水。
[0071]表1為在起始處理時間為7min，不同冷休克時間下的處理效果。
[0072]第一行為對照組：直接將四倍體泥鰍的精子稀釋液與四倍體泥鰍的卵子進行授
ο
[0073]表1不同冷休克時間下的處理效果
【權利要求】
1.一種異源精子誘導泥鰍雌核發育四倍體魚苗的方法，其步驟如下： A、親本的選取與人工催產 選擇體形正常、外表無傷、體質健壯、腹部膨大有彈性、卵巢輪廓明顯的四倍體雌性泥鰍，雄性團頭魴胸鰭珠星明顯、有粗糙感、輕壓腹部有白色精液從生殖孔流出； B、精子的遺傳滅活 采集團頭魴精子，鏡檢選取活力在90%以上的用于紫外線滅活，團頭魴精液lml，用Hank’ s溶液按照1:4體積比稀釋，置于經預冷的直徑75mm干燥培養皿中，精液厚度為O. 1-0. 2mm，然后置于2支15W紫外燈下處理；燈管與靜液面距離10_12mm，滅活時間20-25min，精子的活力水平下降到30%時，停止光照，處理過的精液置于4°C冰箱中，避光保存備用； C、團頭魴精子誘導泥鰍雌核發育 將稀釋的精液200-600μ?加入到含5-30ml四倍體泥鰍未受精卵的瓷盆中，混合均勻，隨后加入5-10ml 7% w/v生理鹽水，繼續混勻后，加入50_200ml曝氣水； D、冷休克處理： 采用0-4°C冰水混合物在授精后2-10min進行冷休克處理，處理持續時間20_55min ； F.孵化 受精卵經冷休克處理后，轉移至23°C的水浴中復溫；最后在曝氣水中孵化； 所述的曝氣水為水溫23 - 25°C，溶氧6. 0-7. Omg/L, pH值在7. 8-8. 2的自來水。
2.根據權利要求2所述的方法，其冷處理條件為：0-4°C冰水混合物在授精后7-8min進行冷休克處理，處理持續時間30min。
【文檔編號】A01K61/00GK103478054SQ201310487227
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年10月17日 優先權日:2013年10月17日
【發明者】周小云, 于永耀, 王衛民 申請人:華中農業大學