一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法，該方法為：首先按照粳稻花藥培養(yǎng)基母液配方配制粳稻花藥培養(yǎng)基母液，然后利用各種母液配制不同時期所用的誘導培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基，再將上述不同時期的培養(yǎng)基分別相對應的運用到粳稻花藥愈傷組織的誘導、綠苗分化、生根三步成苗過程中。采用本發(fā)明后能夠提高粳稻花藥培養(yǎng)的成苗率，加快水稻育種進程，提高水稻優(yōu)良品種的選育效率。
【專利說明】一種提局粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及粳稻花藥培養(yǎng)領域，具體說是一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法【背景技術】
[0002]花藥培養(yǎng)是一種有效快速穩(wěn)定變異材料的手段，自20世紀70年代開展水稻花藥培養(yǎng)育種研究以來，花藥培養(yǎng)已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟而又實用的水稻育種輔助手段；但同時花藥培養(yǎng)存在愈傷組織誘導率和綠苗分化率低、成苗率不高的缺點。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]為了克服現(xiàn)有技術中存在的問題與不足，本發(fā)明的第一目的在于提供一種粳稻花藥培養(yǎng)基母液以及利用該母液配制成的誘導培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基。
[0004]本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述各培養(yǎng)基提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法。
[0005]為了解決上述第一目的，本發(fā)明所采用的技術方案如下:
[0006]一種粳稻花藥培養(yǎng)基母液，包括母液A、母液B、母液C、母液D ;其中:
[0007]母液A包括如下組分:按10倍濃度(即將母液A用水稀釋10倍后母液A工作液濃度)計算，KN0330g/L、ΝΗ4Ν0316.5g/L、KH2P045g/L、MgSO4.7Η203.7g/L、CaCl24.4g/L ；
[0008]母液B包括如下組分:按100倍濃度(即將母液B用水稀釋100倍后母液B工作液濃度)計算，ZnSO4.7H20500mg/L、MnSO4.H201000mg/L、H3B03500mg/L、CuSO4.5H202.5mg/L、KI83mg/L、Na2MoO4.2H2025mg/L、CoCl2.6H202.5mg/L ；
[0009]母液C包括如下組分:按100倍濃度(即將母液C用水稀釋100倍后母液C工作液濃度)計算，Na2-EDTA5.6g/L、Fe2 (SO4) 3.7H204.3g/L ；
[0010]母液D包括如下組分:按100倍濃度(即將母液D用水稀釋100倍后母液D工作液濃度)計算，肌醇10g/L、煙酸0.05g/L、鹽酸硫胺素0.05g/L、鹽酸吡唆醇0.05g/L、甘氨酸
0.2g/L。
[0011]利用上述粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的誘導培養(yǎng)基，包括如下組分:100ml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,5ml濃度為lmg/ml的2.4_D、鹿糖40g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇20g/L、0.lmg/mL的玉米素0.8ml ；pH為5.8。
[0012]上述誘導培養(yǎng)基的制備方法，具體如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,5ml的濃度為lmg/ml的2.4-D,倒入IOOOml的錐型瓶中，加水至600-700ml,混勻；再將水解酪蛋白lg、瓊脂6g、鹿糖40g、山梨糖醇20g,倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH=5.8，得到混合溶液；用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將上述混合溶液移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，待混合溶液溫度降至60-70°C，加入經(jīng)過過濾除菌的0.lmg/mL玉米素0.8ml，混勻，緩緩倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中，待其自然凝固就完成了誘導培養(yǎng)基的配制。
[0013]利用上述粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的分化培養(yǎng)基，包括如下組分:100ml的母液、A、10ml白勺母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml濃度為2mg/ml的6_BA、0.5ml濃度為
0.5mg/ml的NAA, Iml濃度為2mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇10g/L ;pH為5.8。
[0014]上述分化培養(yǎng)基的制備方法，具體如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml濃度為2mg/ml的6_BA、0.5ml濃度為0.5mg/ml的NAA, Iml濃度為2mg/ml的苯乙酸倒入IOOOml的錐型瓶中，加水到600_700ml的位置,混勻；然后將鹿糖30g、瓊脂6g、水解酪蛋白lg、山梨糖醇IOg倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml,調(diào)節(jié)pH=5.8 ;用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將分化培養(yǎng)基移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中，待其自然凝固就完成了分化培養(yǎng)基的配制。
[0015]利用上述粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的生根培養(yǎng)基，包括如下組分:100ml的母液AUOml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白lg/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/L ；pH為5.8。
[0016]上述生根培養(yǎng)基的制備方法，具體如下:取IOOml的母液A、10ml的母液B、IOml的母液C、10ml的母液D倒入IOOOml的錐型瓶中，加水到600_700ml的位置，混勻；再將蔗糖30g、瓊脂6g、水解酪蛋白lg、山梨糖醇10g、多效唑2mg倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH=5.8 ;用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將生根培養(yǎng)基移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)瓶中，待其自然凝固就完成了生根培養(yǎng)基的配制。
[0017]為了解決上述第二目的， 申請人:經(jīng)過多年反復試驗，在諸多花藥培養(yǎng)方案中發(fā)現(xiàn)，以下方法可以很好地實現(xiàn)發(fā)明目的，具體如下:
[0018]一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法，該方法包括以下步驟:
[0019]I)按照上述粳稻花藥培養(yǎng)基母液配方配制粳稻花藥培養(yǎng)基母液；備用；
[0020]2)取孕穗期劍葉葉枕距2_5cm的幼穗，在8~10°C預處理7_10d，消毒；取花粉處于單核時期的花藥接種在上述誘導培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)；接種結(jié)束后將述誘導培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，關閉培養(yǎng)箱中所有燈管，并用報紙或黑布遮蓋培養(yǎng)箱透光處，防止外界光線射入，設定箱內(nèi)溫度為24-26°C，進行為期21-35天的暗處理，形成了愈傷組織；
[0021]3)將步驟2)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到上述分化培養(yǎng)基上；智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為24-26°C，設定光照時間為14小時/天，暗處理時間8小時/天；
[0022]4)愈傷組織在上述分化培養(yǎng)基上經(jīng)過15天的分化形成根和芽，長出綠色小苗，將綠色小苗從分化培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上；智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為27°C，設定光照時間為14小時/天，暗處理時間8小時/天，得到試管苗；
[0023]5)煉苗移植:綠色小苗轉(zhuǎn)入上述生根培養(yǎng)基培養(yǎng)3日后，所有試管苗均開始發(fā)根，當試管苗綠苗長至7~8cm，，具有5~10條長約0.5~Icm長的根時，從試管中取出綠苗，洗去根部培養(yǎng)基，清水培養(yǎng)；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮陽網(wǎng)遮蓋；一周后移種大田。
[0024]本發(fā)明具有以下有益效果:本發(fā)明方法適用于常規(guī)粳稻花藥愈傷組織的誘導、綠苗分化、生根三步成苗過程，能夠提高粳稻花藥培養(yǎng)的成苗率，加快水稻育種進程，提高水稻優(yōu)良品種的選育效率?！揪唧w實施方式】
[0025]本發(fā)明一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法包括以下步驟:
[0026]( I)粳稻花藥培養(yǎng)基母液的配制
[0027]花藥培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基母液主要包括四個部分:母液A、母液B、母液C、母液D，此外還包括一些植物生長調(diào)節(jié)劑。下表是其主要成分及其濃度:
[0028]表1:母液A:大量元素，按10倍濃度計算
[0029]
[0030]表1中10倍MS培養(yǎng)基母液濃度作為對照組。10倍母液A濃度指的是母液A用水稀釋10倍后的母液A工作液濃度。
[0031]表2母液B:微量元素，按100倍濃度計算
[0032]
[0033]
[0034]表2中100倍MS培養(yǎng)基母液濃度作為對照組。100倍母液B濃度指的是母液B用水稀釋100倍后母液B工作液濃度。
[0035]表3母液C:鐵鹽，按100倍濃度計算
[0036]
【權利要求】
1.一種粳稻花藥培養(yǎng)基母液，其特征在于，包括母液A、母液B、母液C、母液D ;其中 母液A包括如下組分:按10倍濃度計算，KNO3 30 g/L,NH4NO3 16.5g/L、KH2PO4 5g/L、MgSO4.7H20 3.7g/L、CaCl2 4.4g/L ； 母液B包括如下組分:按100倍濃度計算，ZnSO4.7Η20 500mg/L ,MnSO4.Η20 1000mg/UH3BO3 500mg/L、CuSO4.5Η20 2.5mg/L、KI 83mg/L、Na2MoO4.2H20 25mg/L、CoCl2.6H202.5mg/L ； 母液C包括如下組分:按100倍濃度計算，Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2(SO4)3.7H20 4.3g/L ； 母液D包括如下組分:按100倍濃度計算，肌醇10g/L、煙酸0.05g/L、鹽酸硫胺素0.05g/L、鹽酸吡哆醇0.05g/L、甘氨酸0.2g/L。
2.根據(jù)權利要求1所述的粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的誘導培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下組分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D,5ml濃度為Img/ml的2.4-D、鹿糖40g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇20g/L、0.1mg/mL的玉米素0.8ml ；pH 為 5.8。
3.根據(jù)權利要求2所述的誘導培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，取100ml的母液Α、10ml白勺母液B、10ml白勺母液C、10ml的母液D,5ml的濃度為1mg/ml的2.4-D,倒入1000ml的錐型瓶中，加水至600-700ml,混勻；再將水解酪蛋白lg、瓊脂6g、鹿糖40g、山梨糖醇20g,倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH=5.8，得到混合溶液；用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將上述混合溶液移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，待混合溶液溫度降至60-70°C，加入經(jīng)過過濾除菌的0.1mg/mL玉米素0.8ml，混勻，緩緩倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中，待其自然凝固就完成了誘導培養(yǎng)基的配制。
4.根據(jù)權利要求1所述的粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的分化培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下組分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D,2ml濃度為2mg/ml的6-BA、0.5 ml濃度為0.5 mg/ml的NAA, 1 ml濃度為2 mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇10g/L ；pH為5.8。
5.根據(jù)權利要求4所述的分化培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D, 2ml濃度為2mg/ml的6-ΒΑ、0.5 ml濃度為0.5mg/ml的NAA, 1 ml濃度為2 mg/ml的苯乙酸倒入1000ml的錐型瓶中，加水到600-700ml的位置，混勻；然后將蔗糖30g、瓊脂6g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇IOg倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH=5.8 ;用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將分化培養(yǎng)基移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中，待其自然凝固就完成了分化培養(yǎng)基的配制。
6.根據(jù)權利要求1所述的粳稻花藥培養(yǎng)基母液配成的生根培養(yǎng)基，其特征在于，包括如下組分:100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白1 g/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/ L ;pH為5.8。
7.根據(jù)權利要求6所述的生根培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，取100ml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D倒入1000ml的錐型瓶中，加水到600-700ml的位置，混勻；再將鹿糖30g、瓊脂6g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10g、多效唑2mg倒入錐型瓶中，加熱混勻，定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH=5.8 ;用玻璃紙密封錐型瓶口后進行滅菌；滅菌結(jié)束以后，將生根培養(yǎng)基移至已經(jīng)過紫外光殺菌的凈化工作臺上，倒入已經(jīng)經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)瓶中，待其自然凝固就完成了生根培養(yǎng)基的配制。
8.一種提高粳稻花藥培養(yǎng)效率的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 1)按照權利要求1所述粳稻花藥培養(yǎng)基母液配方配制粳稻花藥培養(yǎng)基母液；備用； 2)取孕穗期劍葉葉枕距2-5cm的幼穗，在8~10°C預處理7_10d，消毒；取花粉處于單核時期的花藥接種在所述誘導培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)；接種結(jié)束后將述誘導培養(yǎng)基移至智能光照培養(yǎng)箱，關閉培養(yǎng)箱中所有燈管，并用報紙或黑布遮蓋培養(yǎng)箱透光處，防止外界光線射入，設定箱內(nèi)溫度為24-26°C，進行為期21-35天的暗處理，形成了愈傷組織；其中所述誘導培養(yǎng)基包括如下組分:100ml的母液A、IOml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D，5ml濃度為lmg/ml的2.4-D、鹿糖40g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白I g/L、山梨糖醇20g/L、0.1mg/mL的玉米素0.8ml ；pH為5.8 ; 3)將步驟2)中得到的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上；智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為24-26°C，設定光照時間為14小時/天，暗處理時間8小時/天；其中所述分化培養(yǎng)基包括如下組分:100ml的母液A、IOml的母液B、IOml的母液C、IOml的母液D,2ml濃度為2mg/ml的6-BA、0.5 ml濃度為0.5 mg/ml的NAA, I ml濃度為2 mg/ml的苯乙酸、鹿糖30g/L、瓊脂6g/L、水解 酪蛋白I g/L、山梨糖醇10g/L ；pH為5.8 ; 4)愈傷組織在分化培養(yǎng)基上經(jīng)過15天的分化形成根和芽，長出綠色小苗，將綠色小苗從分化培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上；智能光照培養(yǎng)箱，設定溫度為27°C，設定光照時間為14小時/天，暗處理時間8小時/天，得到試管苗；其中所述生根培養(yǎng)基包括如下組分:IOOml的母液A、10ml的母液B、10ml的母液C、10ml的母液D、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L、水解酪蛋白I g/L、山梨糖醇10g/L、多效唑2mg/ L ;pH為5.8 ; 5)煉苗移植:綠色小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基培養(yǎng)3日后，所有試管苗均開始發(fā)根，當試管苗綠苗長至疒8cm，，具有5~10條長約0.5~Icm長的根時，從試管中取出綠苗，洗去根部培養(yǎng)基，清水培養(yǎng)；隔日移栽至花培苗圃中的事先做好的秧田里，使用遮陽網(wǎng)遮蓋；一周后移種大田。
【文檔編號】A01H4/00GK103461141SQ201310451345
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】余波, 林添資, 龔紅兵, 景德道, 周義文, 盛生蘭, 李闖, 錢華飛, 曾生元 申請人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學研究所