一種無菌松材線蟲的制備方法
【專利摘要】一種無菌松材線蟲的制備方法是涉及無菌松材線蟲的制備方法的改進。本發明提供一種靈敏快速的無菌松材線蟲的制備方法。本發明包括以下步驟：將葡萄孢接種于PDA培養基上，25℃恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲；將接種后的培養皿置25℃恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4℃儲存備用。
【專利說明】一種無菌松材線蟲的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明是涉及無菌松材線蟲的制備方法的改進。
【背景技術】
[0002]松材線蟲病是松材線蟲引起的松樹的一種毀滅性病害，又稱松樹萎蔫病。松材線蟲病具有導致樹木死亡速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點，松樹一旦感染松材線蟲，最快的40天左右即可枯死，幼苗感病后20多天即可枯死，3-5年便可造成大面積毀林。我國于1982年在南京中山陵首次發現松材線蟲病，此后，該病在我國境內迅速擴散蔓延，危害日趨嚴重，現已在江蘇、浙江、安徽、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、陜西、香港及臺灣等地區發生，發生面積達8.7萬公頃，累計致死松樹3，500多萬株，因松材線蟲病造成的直接經濟損失已達25億元，間接損失達250億，使我國的松木資源、自然景觀和生態環境遭受嚴重影響。
【發明內容】
[0003]本發明就是針對上述問題，提供一種靈敏快速的無菌松材線蟲的制備方法。
[0004]為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案，本發明包括以下步驟。
[0005]1)將葡萄孢接種于PDA培養基上，25 °C恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲；將接種后的培養皿置25°C恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4°C儲存備用。
[0006]2)松材線蟲的分離采用貝爾曼漏斗分離法；其裝置是將直徑10-15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一個1.5ml離心管，橡皮管上裝一個彈簧夾；在漏斗內放一個用細銅紗制成的漏斗狀網篩，將面巾紙或濾紙裁剪好后放置到漏斗狀網篩上，用蒸餾水浸濕濾紙，然后將待分離的培養基材料切碎放置到濾紙上；力口水淹沒待分離培養基材料，靜止分離24h ;由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開培養基材料，沉降到漏斗底部的離心管中；關閉彈簧夾，取下離心管，將管中收集到的線蟲轉移至另一離心管中備用。
[0007]作為一種優選方案，本發明還包括以下步驟。
[0008]將消毒松材線蟲蟲卵培養后獲得的松材線蟲，在無菌條件下用無菌水從灰葡萄孢斜面上收集下來，在無菌條件下研磨成線蟲勻漿，取一部分勻漿均勻涂在NA平板上，放置到28°C恒溫培養箱中培養三天，以檢測蟲卵消毒效果。
[0009]作為另一種優選方案，本發明還包括以下步驟。
[0010]將消毒后松材線蟲勻漿用做PCR模板，未做消毒處理的線蟲勻漿作為對照，同時以無菌水和大腸桿菌菌液分別作為陰性對照和陽性對照，以細菌通用引物進行PCR擴增，檢測松材線蟲消毒效果。
[0011]本發明有益效果:本發明采用PCR方法檢測消毒效果可彌補傳統培養方法的缺點，結合對線蟲和蟲卵進行多步消毒的方法，建立了獲得無菌線蟲的技術。與傳統培養檢測的方法相比，PCR方法檢測細菌污染更靈敏更快速，可檢測到1克樣品中存在的0.4CFU(colonyformingunits)的污染。
【具體實施方式】
[0012]本發明采用如下技術方案，本發明包括以下步驟。
[0013]1)將葡萄孢接種于PDA培養基上，25 °C恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲；將接種后的培養皿置25°C恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4°C儲存備用。
[0014]2)松材線蟲的分離采用貝爾曼漏斗分離法；其裝置是將直徑10-15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約10cm的橡皮管，在橡皮管末端接一個1.5ml離心管，橡皮管上裝一個彈簧夾；在漏斗內放一個用細銅紗制成的漏斗狀網篩，將面巾紙或濾紙裁剪好后放置到漏斗狀網篩上，用蒸餾水浸濕濾紙，然后將待分離的培養基材料切碎放置到濾紙上；力口水淹沒待分離培養基材料，靜止分離24h ;由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開培養基材料，沉降到漏斗底部的離心管中；關閉彈簧夾，取下離心管，將管中收集到的線蟲轉移至另一離心管中備用。
[0015]本發明還包括以下步驟。
[0016]將消毒松材線蟲蟲卵培養后獲得的松材線蟲，在無菌條件下用無菌水從灰葡萄孢斜面上收集下來，在無菌條件下研磨成線蟲勻漿，取一部分勻漿均勻涂在NA平板上，放置到28°C恒溫培養箱中培養三天，以檢測蟲卵消毒效果。
[0017]本發明還包括以下步驟。
[0018]將消毒后松材線蟲勻漿用做PCR模板，未做消毒處理的線蟲勻漿作為對照，同時以無菌水和大腸桿菌菌液分別作為陰性對照和陽性對照，以細菌通用引物進行PCR擴增，檢測松材線蟲消毒效果。
[0019]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明，對于本發明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明所提交的權利要求書確定的保護范圍。
【權利要求】
1.一種無菌松材線蟲的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將葡萄孢接種于PDA培養基上，25°C恒溫培養箱中培養7天，待氣生菌絲基本長滿培養皿時接種松材線蟲，每皿接種約200頭線蟲；將接種后的培養皿置25°C恒溫培養箱中培養10-14天，待菌絲基本被線蟲消耗完后，置于4°C儲存備用； 2)松材線蟲的分離采用貝爾曼漏斗分離法；其裝置是將直徑10-15cm的玻璃漏斗架在鐵架上，下面接一段約1cm的橡皮管，在橡皮管末端接一個1.5ml離心管，橡皮管上裝一個彈簧夾；在漏斗內放一個用細銅紗制成的漏斗狀網篩，將面巾紙或濾紙裁剪好后放置到漏斗狀網篩上，用蒸餾水浸濕濾紙，然后將待分離的培養基材料切碎放置到濾紙上；加水淹沒待分離培養基材料，靜止分離24h ;由于趨水性和自身的重量，線蟲就離開培養基材料，沉降到漏斗底部的離心管中；關閉彈簧夾，取下離心管，將管中收集到的線蟲轉移至另一離心管中備用。
2.根據權利要求1所述一種無菌松材線蟲的制備方法，其特征在于還包括以下步驟: 將消毒松材線蟲蟲卵培養后獲得的松材線蟲，在無菌條件下用無菌水從灰葡萄孢斜面上收集下來，在無菌條件下研磨成線蟲勻漿，取一部分勻漿均勻涂在NA平板上，放置到28°C恒溫培養箱中培養三天，以檢測蟲卵消毒效果。
3.根據權利要求2所述一種無菌松材線蟲的制備方法，其特征在于還包括以下步驟: 將消毒后松材線蟲勻漿用做PCR模板，未做消毒處理的線蟲勻漿作為對照，同時以無菌水和大腸桿菌菌液分別作為陰性對照和陽性對照，以細菌通用引物進行PCR擴增，檢測松材線蟲消毒效果。
【文檔編號】A01K67/033GK104430184SQ201310417640
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月14日 優先權日:2013年9月14日
【發明者】姜丹寧, 李 杰, 齊曉倩 申請人:姜丹寧