楝樹染色體加倍方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種楝樹染色體加倍方法。本發(fā)明技術方案是采集楝樹外殖體，消毒滅菌，將殖體進行培養(yǎng)，誘導產生愈傷組織并分散成懸浮細胞進行懸浮培養(yǎng)，處理愈傷組織，染色體加倍，將愈傷組織轉接到初代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，再轉接到生芽培養(yǎng)基中誘導不定芽，將不定芽放入增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，用椰糠和土配成的混合基顧進行煉苗，篩選出加倍后的植株種苗。本發(fā)明克服了不能有效的對楝樹等木本植物進行染色體加倍的缺陷。本發(fā)明培育出的多倍體楝樹果實大，產量高，含楝素高，植株健壯粗大，能夠有效提高楝樹的利用率，大大減少了其生產的成本，提高了經濟價值。
【專利說明】楝樹染色體加倍方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術育種領域，專用于楝樹的染色體工程和倍性育種，特別涉及一種楝樹染色體加倍方法。
【背景技術】
[0002]楝樹具有極高的經濟價值，特別是所含有效的化學物質如楝素等，但天然楝樹的果實比較小，其中的楝素也就很少。因此如何提高楝樹果實的大小，以及果實中有效化學物質的含量成為楝樹エ業(yè)發(fā)展的瓶頸。
[0003]在本發(fā)明之前，沒有專門針對楝樹的染色體加倍方法。其他染色體加倍的方法例如丹參染色體加倍方法等都只針對草本植物，不能有效的對楝樹等木本植物進行染色體加倍，本發(fā)明解決了楝樹的染色體加倍的技術難題。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種楝樹染色體加倍方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案是:
[0006]楝樹染色體加倍的方法，其主要技術特征在于以下步驟:
[0007](I)采集楝樹外殖體；
[0008](2)用消毒試劑對楝樹外植體滅菌；
`[0009](3)將楝樹外殖體轉接到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，誘導產生愈傷組織；
[0010](4)將愈傷組織分散成懸浮細胞，進行懸浮培養(yǎng)；
[0011 ](5)使用化學物質處理愈傷組織，實現染色體加倍；
[0012](6)將染色體加倍的愈傷組織轉接到初代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0013](7)將愈傷組織轉接到生芽培養(yǎng)基中誘導不定芽；
[0014](8)將分化出的不定芽放入増殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；
[0015](9)接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)；
[0016](10)用椰糠和土配成的混合基質進行煉苗，煉苗后移栽；
[0017](11)進行染色體數目觀察，篩選出加倍后的植株種苗。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點和效果在于培育出的多倍體楝樹果實大,產量高,含楝素高，植株健壯粗大，能夠有效提聞棟樹的利用率，大大減少了其生廣的成本，提聞了經濟價值。
[0019]本發(fā)明的其他具體優(yōu)點和效果將在下面繼續(xù)說明。
【具體實施方式】
[0020]本發(fā)明的技術思路是:
[0021]多倍體植株大多比較粗壯，產量明顯提高，抗寒、抗旱、抗病能力加強，具有一定的優(yōu)越性。但是在自然界中多倍體自發(fā)情況極少，而且發(fā)生的變異大多不定向。本發(fā)明用化學物質秋水仙素處理愈傷組織從而誘導多倍體，利用的是愈傷組織分化程度低、細胞分裂快、再生能力強的特點。不僅可以大大縮短所需時間，誘發(fā)成功率高，而且材料易得，易處理。大致流程如下:外植體一愈傷組織一多倍體植株一檢驗一擴繁。
[0022]本發(fā)明方法包括以下具體步驟:
[0023](1)外殖體采集:選擇睛朗的天氣，在上午葉面無露水時進行采集。挑選健壯、無病蟲害的植株，用較鋒利的剪刀剪下枝梢半木質化部分，切除頂梢幼嫩段，只保留半木質化段。在腋芽上下3cm處切下腋芽，并只保留3cm左右的葉柄，切ロ要求平滑不裂，以利于隨后的消毒處理。
[0024](2)外殖體消毒:將上述采集的外殖體在無菌的情況下，采用特別配制的消毒試劑進行消毒，處理方法為:
[0025]方法一洗潔精沖洗3遍，0.1 %~0.2%高錳酸鉀35min，10%~20%次氯酸鈉溶液Ih (加1%吐溫20)，1~3%山農一號I型與抗生素溶液lh，其中抗生素含鏈霉素、頭孢霉素、制霉菌素，且濃度均為3~7%，75%こ醇30秒，每個試劑處理后均要用無菌水沖洗3遍。
[0026]方法二洗潔精沖洗3~5遍，75%こ醇30秒，10%次氯酸鈉溶液lh，1%氯化汞溶液IOmin,姆個試劑處理后均要用無菌水沖洗3遍。
[0027](3)誘導產生愈傷組織:每隔14天，將外殖體轉接到新的愈傷組織的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2。25±2°C培養(yǎng)，無需光照。
[0028](4)懸浮細胞培養(yǎng)愈傷組織:將愈傷分散后,接種在液體培養(yǎng)中上，125rpm振蕩培養(yǎng)。姆隔3~5天換一次培養(yǎng)基,一段時間后觀察愈傷狀態(tài)。懸浮細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為:MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BAl.5mg,NAA0.025mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無需光照。
[0029](5)使用化學物質處理愈傷組織誘導染色體加倍:在無菌環(huán)境下，分別將愈傷組織、幼苗、懸浮細胞的混合物用0.25%濃度的秋水仙素溶液處理2.5h，秋水仙素溶液內需加入I %的二甲基亞砜兩滴。處理后用無菌水沖洗2~3次。
[0030](6)挑選愈傷組織進行初代培養(yǎng):挑選細胞分裂快，結構疏松，顔色淺而透明的愈傷組織轉接到初代培養(yǎng)基中。每月轉接一次，大概培養(yǎng)2~3個月。該培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.2mg，三農一號II型2ml，活性炭1.5g，水至I升，調整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0031](7)利用愈傷組織誘導不定芽:將愈傷組織放入培養(yǎng)基中誘導不定芽，20~25天轉接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.5mg，NAA0.15mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0032](8)增殖培養(yǎng):轉接到增殖培養(yǎng)基后每25~30天轉接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.15mg,水至I升,調整pH至5.8~
6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供16h光照。
[0033](9)生根培養(yǎng):挑選較粗壯的植株，切去葉柄，將枝干切成4~5cm的小段,接種到生根培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠5g，IBA0.15mg /L，水至I升，調整pH至5.8~6.2。
[0034]置于20~28°C和1000~3000Iux光照條件下或日光燈或LED紅光燈作為照明光源培養(yǎng)。每天提供16~24h光照。
[0035](10)出瓶移栽:移栽組培苗可用椰糠:土 =1:1的土壤作為基質。在植株的根長至3~5cm長時，即可出瓶移栽。移栽前先將瓶苗置于蔭棚中訓化培養(yǎng)7~10天，開蓋后再放置3~5天。移栽時用竹筷或鑷子將瓶苗輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基后用1%。的多菌靈浸泡7min,栽入育苗杯中,澆透水后用地膜覆蓋,培養(yǎng)。
[0036](11)染色體檢測:取候選加倍楝樹植株的莖尖或根尖組織，進行染色體數目觀察，篩選加倍植株的楝樹種苗，以便用于進一步擴繁生產。
[0037]實施例:
[0038](I)在上午葉面無露水時，選取健壯、無病蟲害的楝樹植株，取頂稍幼嫩段的外殖體20個。
[0039](2)將上述外殖體用消毒試劑進行消毒。消毒試劑采用及處理時間如下:洗潔精沖洗3遍，0.2%高錳酸鉀20min，10%次氯酸鈉溶液1.5h (加I %吐溫20)，培養(yǎng)基中加過濾的1%山農一號I型與抗生素溶液2.5h(其中含鏈霉素、頭孢霉素、制霉菌素,且濃度均為3% )，75%乙醇20秒，每個試劑處理后均要用無菌說沖洗3遍。
[0040](3)每隔14天，將外殖體轉移到新的愈傷組織的培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基是在正常MS培養(yǎng)基中加鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5mg,NAA0.05mg,水至I升,調整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無需光照。
`[0041](4)將愈傷組織分散后懸浮，接種在液體培養(yǎng)基中，進行震蕩培養(yǎng)。每隔3~5天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5mg, NAA0.05mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2。25 ±2 °C培養(yǎng)，無需光照，搖床轉速150rpm。
[0042](5)在無菌環(huán)境下，分別將愈傷組織，幼苗，懸浮細胞的混合物用0.1 %濃度的秋水仙素溶液浸泡處理5h，秋水仙素溶液內需加入1%的二甲基亞砜兩滴。處理后用無菌水沖洗2~3次。
[0043](6)將外殖體轉接到初代培養(yǎng)基中，每月轉接一次，大概培養(yǎng)2~3個月。該培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.2mg，三農一號II型1ml，活性炭
0.5g，水至I升，調整pH至5.8~6.2。25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0044](7)將愈傷組織放入培養(yǎng)基中誘導不定芽，20天轉接一次。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,調整pH至5.8~
6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供24h光照。
[0045](8)每25天轉接一次到增殖培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基為3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.3mg,NAA0.05mg,水至I升,調整pH至5.8~6.2。培養(yǎng)條件為:25±2°C和2000IUX光照條件下或日光燈照明培養(yǎng)，也可使用LED紅燈作為光源進行培養(yǎng)。每天提供16h光照。
[0046](9)挑選較粗壯的植株，切去葉柄，將枝干切成4cm的小段，接種到生根培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖60g，卡拉膠7.5g，IBA0.05mg / L，水至I升，調整pH至5.8~6.2。置于25±2°C和2000Iux光照條件下或日光燈或LED紅光燈作為照明光源培養(yǎng)。每天提供16光照。
[0047](10)移栽組培苗用椰糠:土壌=I:1的土壤作為基質。在植株的根長至4cm長時，出瓶移栽。移栽前先將瓶苗置于蔭棚中訓化培養(yǎng)7天，開蓋后再放置3天。移栽時用鑷子將瓶苗輕輕取出，洗凈培養(yǎng)基后用1%。的多菌靈浸泡5min，栽入育苗杯中，澆透水后用地膜
覆蓋，培養(yǎng)。
[0048](11)取加倍后楝樹植株的莖尖或根尖組織，進行染色體數目觀察，篩選加倍植株的楝樹種苗， 以便用于進ー步擴繁生產。
[0049]本發(fā)明要求保護的范圍并不僅僅局限于上述【具體實施方式】的說明。
【權利要求】
1.楝樹染色體加倍方法，其特征在于以下步驟: (1)采集楝樹外殖體； (2)用消毒試劑對楝樹外植體滅菌； (3)將楝樹外殖體轉接到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，誘導產生愈傷組織； (4)將愈傷組織分散成懸浮細胞，進行懸浮培養(yǎng)； (5)使用化學物質處理愈傷組織,實現染色體加倍； (6)將染色體加倍的愈傷組織轉接到初代培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； (7)將愈傷組織轉接到生芽培養(yǎng)基中誘導不定芽； (8)將分化出的不定芽放入增殖培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)； (9)接種到生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)； (10)用椰糠和土配成的混合基質進行煉苗，煉苗后移栽； (11)進行染色體數目觀察，篩選出加倍后的植株種苗。
2.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(2)中，消毒試劑包括:洗潔精，高錳酸鉀，次氯酸鈉溶液，無菌水，山農一號I型，抗生素溶液，75 %乙醇，氯化汞。
3.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(3)中的培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了鹿糖40g,卡拉膠7.5g, 6-BA0.5~2mg,NAA0.01~0.05mg,水至I升，調整pH至5.8~6.2。
4.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(4)中懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基在正常的MS培養(yǎng)基中添加了蔗糖40g，6-BA0.5~2mg，NAA0.01~0.05mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2，搖床轉速100~150rpm。
5.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(5)中的化學物質為秋水仙素；處理濃度與方法為:在無菌環(huán)境下將濃度為0.1~0.5%的秋水仙素藥液過濾，再把經過懸浮培養(yǎng)的愈傷組織浸泡于上述藥液中處理I~5h，之后用無菌說沖洗2~3次。
6.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(6)中的初代培養(yǎng)基的配方為:MS基本培養(yǎng)基添加了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，TDZ0.1~0.3mg,山農一號II型I~3ml，活性炭0.5~2g，水至I升，調整pH至5.8~6.2。
7.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(7)中的生芽培養(yǎng)基配方為:3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，調整pH至5.8~6.2。
8.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(8)中的增殖培養(yǎng)基配方為:3 / 2MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠7.5g，6-BA0.3~0.7mg，NAA0.05~0.2mg，水至I升，調 整pH至5.8~6.2。
9.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(9)中的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基中加入了蔗糖40g，卡拉膠5~10g，IBA0.05-2mg / L，水至I升，調整pH至 5.8 ~6.2。
10.根據權利要求書I中所述的楝樹染色體加倍方法，其特征在于步驟(10)中培養(yǎng)組培苗的混合基質的成分為椰糠和土壤混合物，混合比例為1:2~2:1。
【文檔編號】A01H4/00GK103598088SQ201310403061
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年9月5日 優(yōu)先權日:2013年9月5日
【發(fā)明者】王臺虎 申請人:南京大淵美容保健有限公司