一株乳酸鏈球菌及在微生物發酵制備飼料添加劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一株能夠發酵利用豆粕并產生Nisin的微生物菌種——乳酸鏈球菌（Streptococcus?lactis）2013-DP1，及其在微生物發酵制備飼料添加劑中的應用。該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學，郵編：430072，保藏日期：2013年6月21日，保藏編號：CCTCC?No：M2013275。利用該菌株可以進行豆粕等飼料原料的發酵處理，既可以提高飼料原料中蛋白質和可溶性小肽（酸溶蛋白）的含量，也產生較高活性的Nisin。該菌株用于飼料產業，具有極大的市場潛力。
【專利說明】一株乳酸鏈球菌及在微生物發酵制備飼料添加劑中的應用(-)【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及經篩選誘變獲得的一株新菌株-乳酸鏈球菌(Streptococcus
lactis) 2013-DP1，及其在微生物發酵制備飼料添加劑中的應用 。
(二)【背景技術】
[0002]飼料行業及相關產品中，為了畜禽疾病的防治，往往在飼料中添加抗生素。隨著抗生素的大量廣泛用于飼料中和人們對食品質量的要求越來越高，抗生素的副作用及潛在的危害和風險已經日益暴露出來。抗生素的長期添加使用，能使許多病原菌產生耐藥性，同時，在畜產品中產生嚴重的藥物殘留，從而對人類健康產生了嚴重的不利影響，抗生素在飼料業中的應用，已面臨著淘汰或禁用的局面。開發無毒無公害的新型微生態制劑和抗菌劑等來代替或降低抗生素使用量，已成為飼料添加劑研發的一項緊迫的任務。
[0003]抗菌肽是生物體內產生的一種具有抗菌活性的小分子多肽，由20~60個氨基酸殘基組成，具有強堿性、熱穩定性、抗菌活性高和抗菌譜廣等特點。抗菌肽具有與抗生素不同的抗菌機制，它主要作用于細胞膜，造成細胞膜的穿孔，這樣就不需要一些特殊的受體，因此靶菌株不易產生抗性突變。抗菌肽在醫藥、食品、飼料中已經開始應用。利用能夠產生抗菌肽的微生物來發酵生產飼料微生態添加劑是一條很有潛力的途徑，此類添加劑在提高動物的飼料利用率，增加生產性能，調節腸道微生態平衡，增加免疫力等方面具有顯著的促進作用。此類添加劑還具有無毒副作用、無殘留、不引起抗藥性等優點，可以替代或降低抗生素使用，用于動物生產可以大幅提高我國畜產品的國際競爭力。
[0004]乳酸鏈球菌素(Nisin)是由乳酸鏈球菌產生的一種抗菌肽,成熟的Nisin分子由34個氨基酸殘基組成，其化學結構包含有由5個硫醚橋組成的分子內環，分子量為3510Da。Nisin能夠有效地抑制大多數革蘭氏陽性細菌的生長，比如金黃色葡萄球菌、小球菌、明串珠菌、李斯特氏菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、肉毒梭狀芽孢桿菌等，因而被廣泛用作食品綠色防腐劑。然而在飼料產業中，Nisin尚未被廣泛應用。Nisin用于飼料添加劑的優點主要體現在兩個方面:一是用作添加劑后可以有效的防止沙門氏菌等致病菌的污染，保障飼料的品質，減少防腐劑的應用，降低對于飼養動物以及食用人體的危害；二是對于飼養動物的作用，Nisin可以有效的防止致病菌對動物腸道的影響，可以有效的抑制腸道內致病菌并降低致病率，但不會影響動物腸道內的有益微生物的生長，減少抗生素的使用，而且Nisin進入腸道后會被蛋白酶降解，不會在體內殘留。
[0005]此外，近年來我國畜牧業的迅猛發展造成了國內常規飼料資源短缺，尤其是蛋白飼料資源的缺乏顯得尤為突出，缺口很大。大豆和魚粉是主要的飼料蛋白原料，近年來大豆的需求不斷增加，據統計，2008年我國進口大豆達到3743萬噸，2013年預計全年進口大豆即將突破6000萬噸。而進口魚粉也是量價齊升，給養殖業帶來沉重的負擔。因此，開發新型的蛋白詞料來源和生廣聞品質的蛋白詞料也已成為詞料生廣的緊迫任務。
[0006]隨著我國農業、食品工業的發展，農產品及食品在加工過程中產生了大量的柏類、糟渣類廢棄物。據不完全統計，我國僅釀造、調味品、味精、淀粉、白酒、黃酒、淀粉糖、生物農藥、果品加工工業部門每年度可生產糟渣約7000萬噸。這些含蛋白的廢棄物，常常被人們簡單處理，不能發揮其潛有功能。近年來，人們漸漸發現，利用微生物發酵的方法，可以對其進行科學利用，不但可減輕環境壓力，減少資源浪費，同時也能夠提高企業的經濟效益。例如豆柏，它是大豆等提取脂肪類物質后的副產物，豆柏類物質已經成功開發成為可部分替代魚粉的植物蛋白飼料原料，近年來豆柏已經在養殖業中廣泛應用。研究表明利用微生物發酵法處理豆柏后，可以通過微生物生長利用以及分泌的蛋白酶系對豆柏中的抗營養因子和抗原蛋白進行一定程度的降解，降低這些不良物質在豆柏中的水平，顯著改善豆柏的營養品質，實現?柏的聞效利用。
(三)
【發明內容】
[0007]針對以上問題，本發明提供了一株能夠發酵利用豆柏并產生Nisin的微生物菌
種-乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)2013-DP1,及其在微生物發酵制備飼料添加劑
中的應用。
[0008]本發明采用的技術方案是: [0009]一株乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)2013_DPl,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號:CCTCC No:M2013275o
[0010]本發明通過紫外誘變法同時對該菌產生Nisin和發酵利用轉化豆柏的能力進行了改良育種，獲得了乳酸鏈球菌突變菌株2013-DP1，利用該菌株進行豆柏發酵以生產既產生抗菌肽Nisin又富含酸溶蛋白(可溶性小肽)的蛋白飼料添加劑發酵豆柏。以金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)為指示菌,測定了菌株產生Nisin的能力，發現突變株2013-DP1產Nisin的效價比出發菌株(WT)效價提高了 86.10%(出發菌株平均效價為769.4IU/ml，突變株2013-DP1效價1431.9IU/ml)。乳酸鏈球菌可以很好地利用豆柏為培養基進行發酵生長，發酵豆柏的粗蛋白含量和酸溶蛋白含量都得到提高。本發明中，選育的突變菌株2013-DP1發酵S.柏后,S.柏的粗蛋白、酸溶蛋白含量也比出發菌株提聞:出發菌株發酵豆柏的粗蛋白含量為50.8%，突變菌株2013-0?1為51.2%;出發菌株發酵豆柏的酸溶蛋白含量為8.8%，突變菌株2013-DP1為11.3%。豆柏發酵后，大分子量的蛋白質降解為可溶性的小肽，便于動物消化吸收，顯著提高了飼料原料的營養價值并且改善了動物營養水平和促進了健康。發酵該菌株可以用于飼料蛋白添加劑的生產，同時可以產生抗菌肽Nisin，降低飼料中抗生素的添加量，提高動物養殖水平和動物產品競爭力，給養殖業帶來顯著經濟效益。
[0011]本發明還涉及所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發酵制備抗菌肽Nisin中的應用。
[0012]乳酸鏈球菌菌株2013-DP1可以在MSR培養基上生長繁殖，培養溫度30°C，在該培養基上生長較好并產生高活性Nisin，因此可以利用本發明菌株直接制備Nisin。
[0013]MSR培養基組成如下:蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸鈉 5g/L，檸檬酸二胺 2g/L，Tween801g/L，K2HP042g/L，MgSO4.7Η200.2g/L, MnSO4.H2O0.05g/L，CaC0320g/L，瓊脂15g/L，溶劑為水，pH6.8。培養基在121°C下滅菌20min。
[0014]乳酸鏈球菌菌株2013-DP1菌落、形態學、培養特征:乳酸鏈球菌是一種革蘭氏陽性細菌，能產生乳酸和乳酸鏈球菌素Nisin。在MSR培養基上，乳酸鏈球菌菌落呈現乳白、淡白等顏色，菌落較光滑，濕潤。產生的Nisin主要抑制革蘭氏陽性細菌的生長，如金黃色葡萄球菌等。乳酸鏈球菌菌株2013-DP1可以在含有蛋白胨、酵母膏作為氮源、以蔗糖或可溶性淀粉作為碳源、另外添加KH2PO4以及硫酸鎂或蛋氨酸、半胱氨酸等物質的培養基上生長良好，并產生Nisin。最適培養溫度均為30°C，最適pH為5.5。
[0015]本發明還涉及所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發酵制備富含抗菌肽Nisin和可溶性小肽的飼料添加劑中的應用。
[0016]具體的，所述的應用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50%，再經高溫滅菌制成發酵培養基，接種乳酸鏈球菌2013-DP1，在發酵容器密封條件下，28~32 °C靜置培養48~64h，發酵結束后，發酵產物直接作為飼料添加劑或經自然晾干或在50°C以下適度除水干燥(干燥至含水量為10~15%，w/w)后制成飼料添加劑。
[0017]本發明的有益效果主要體現在:本發明通過紫外誘變選育獲得了一株乳酸鏈球菌2013-DP1，該菌株產生抗菌肽Nisin的能力較出發菌株顯著提高，該菌株轉化利用豆柏蛋白的能力也得到了提高。利用該菌株可以進行豆柏等飼料原料的發酵處理，既可以提高飼料原料中蛋白質和可溶性小肽(酸溶蛋白)的含量，也產生較高活性的Nisin。乳酸鏈球菌發酵的豆柏作為蛋白飼料添加劑用于養殖業，既可以減少價格較高的動物蛋白(如魚粉)的用量，又可以可有效減少抗生素的大量使用，同時幫助提高飼料的消化與吸收，增強對于有害細菌等微生物的抵抗力，改善動物腸道健康，促進其生長。此外，乳酸鏈球菌2013-DP1對豆柏的轉化利用以及分泌的蛋白酶系對豆柏中的抗營養因子和抗原蛋白可以進行一定程度的降解，降低了這些不良物質在豆柏中的水平，顯著改善了豆柏的營養品質，實現豆柏的高效利用。該菌株用于飼料產業，具有極大的市場潛力。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為乳酸鏈球菌素`抑制金黃色葡萄球菌生長結果圖。
(五)【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0020]實施例1:
[0021](I)乳酸鏈球菌分離培養和篩選方法:乳酸鏈球菌進行一定稀釋后涂布在含有指示菌的固體檢測培養基平板上，在30°C培養24h后，測量抑菌圈直徑，挑取抑菌圈直徑與菌落直徑比較大的菌株進行保存后，測定產生Nisin的效價。Nisin對于革蘭氏陽性細菌具有極強的抑菌性，選用金黃色葡萄球菌作為指示菌，通過乳酸鏈球菌產生的Nisin對其具有的抑菌性，使其產生抑菌圈，通過觀察比較抑菌圈直徑來篩選較優的菌株，并對其效價進行評定。
[0022]檢測培養基組成如下:胰蛋白胨8g/L,酵母膏5g/L,葡萄糖5g/L, NaC15g/L,Na2HPO4.12H202g/L, Tween8010g/L，瓊脂 18g/L，溶劑為水，ρΗ6.8。
[0023](2)乳酸鏈球菌紫外誘變方法:將超低溫冰箱保存的菌種劃線接種到MRS培養基上進行活化，在30°C培養箱培養48h。取無菌水1000 μ L加入滅菌EP管，用滅菌牙簽挑取少量活化的菌放入其中，混合均勻后，用血球計數板計數(一般為107CFU/mL數量級)，將其稀釋到104CFU/mL后取4(^1^稀釋菌液，加入到一個滅菌平皿之中，再向其中加入3.61!^無菌水使其稀釋到103CFU/mL，將平皿保持打開狀態，在距離紫外燈光30cm處照射70s，保持黑暗5min后，將誘變菌液涂布到新鮮制備的混合有金黃色葡萄球菌的檢測培養基平板上，將培養皿用黑布包裹后放入培養箱黑暗培養。在30°C培養24h后，取出觀察抑菌圈直徑，挑選出菌落直徑較大、同時抑菌圈直徑也較大的菌株。重復多次實驗，挑選出多個菌株。部分菌株的抑菌圈效果見圖1。
[0024](3) Nisin效價測定方法
[0025]利用管碟法進行各菌株產Nisin的效價測定。將需要檢測的乳酸鏈球菌菌液用
0.02mol/L稀鹽酸稀釋酸化后,沸水浴5min,再5000r/min離心5min去掉沉淀,取上清,將上清液以100 μ L/杯的量注入到放置在混合有指示菌金黃色葡萄球菌的檢測培養基上的牛津杯中，平穩的放入培養箱，在37 °C培養48h后測定抑菌圈直徑。
[0026]Nisin的抑菌圈直徑與其濃度呈線性關系，利用Nisin標準品以不同濃度配制后測定的對指示菌的抑菌圈直徑繪出其標準曲線，將測試菌的抑菌圈直徑與標準曲線進行對t匕，計算出其效價。具體方法是將滅菌后冷卻至50°C左右的溶化的檢測培養基中以2%接入量接入金黃色葡萄球菌懸浮液，利用管碟法，在完全冷卻的培養基上放上滅菌牛津杯，向其中加入濃度依次為10、25、50、75、100幾/1^的附8丨11標準品100 μ L，加完后將其小心平穩地放入37 °C恒溫培養箱中培養48h。
[0027](4)產Nisin較高的乳酸鏈球菌突變株發酵豆柏篩選
[0028]利用上述方法，篩選出產Nisin效價較高的菌株多株，然后繼續進行豆柏、玉米蛋白等飼料原料的發酵研究，篩選獲得發酵蛋白的能力也較強的菌株。
[0029]將菌株分別接種到IOOmL的液體CM培養基中，200r/min，30°C培養24h得到種子液；取豆柏，加水至含水量為45 % (w/w), 121°C下滅菌20分鐘制成發酵培養基，按照10%體積比的接種量接種種子液，混合均勻后，發酵容器用塑料袋密封進行低氧至無氧發酵，30°C靜止培養48h，發酵后的基質低溫(40~45°C)適度除水干燥(干燥至含水量約為10%)制成飼料添加劑成品，進行粗蛋白、酸溶蛋白等指標測定。每個菌株獨立重復三次實驗，每次至少3個平行樣。
[0030]CM液體培養基組成:蔗糖10g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，K2HP0410g/L,NaC12g/L, MgSO4.7H200.2g/L，溶劑為水，pH6.9。
[0031]發酵豆柏(即前述制備的飼料添加劑成品)用凱氏定氮法測定粗蛋白含量，用三氯乙酸法測定酸溶蛋白含量。幾株誘變菌株的Nisin效價以及發酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量測定平均值見表1。從表中可以看出菌株UV-2產Nisin效價較高，該菌株發酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量都得到了提高，說明發酵豆柏的能力得到了改良。因此，選擇菌株UV-2進行保藏，命名為乳酸鏈球菌突變菌株2013-DP1，保藏編號CCTCC No:M2013275。原料豆柏的粗蛋白含量45.93%，酸溶蛋白含量4.58%。
[0032]表1:乳酸鏈球菌誘變菌株發酵豆柏指標測定
[0033]
【權利要求】
1.一株乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis) 2013-DP1,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學，郵編:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏編號:CCTCC No:M2013275o
2.如權利要求1所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發酵制備抗菌肽Nisin中的應用。
3.如權利要求1所述的乳酸鏈球菌2013-DP1在微生物發酵制備飼料添加劑中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的應用為:取豆柏、麩皮、秸桿中的一種或多種，加水至含水量為40~50%，再經高溫滅菌制成發酵培養基，接種乳酸鏈球菌2013-DP1，在發酵容器密封條件下，28~32°C靜置培養48~64h，發酵結束后，發酵產物直接作為飼料添加劑或經自然晾干或在50°C以下除水干燥制成飼料添加劑。
【文檔編號】A23K1/17GK103642709SQ201310383042
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年8月28日 優先權日:2013年8月28日
【發明者】朱廷恒, 汪琨, 崔志峰, 吳斌, 王渭霞 申請人:浙江工業大學