獲得無融合生殖亞麻種子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了獲得無融合生殖亞麻種子的方法。該方法包括以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交，得到雜交當(dāng)代所結(jié)的種子，將所述雜交當(dāng)代所結(jié)的種子進(jìn)行種植培育至開花，去除花藥未成熟花朵的所有雄蕊得到待誘導(dǎo)花朵，用亞麻失活花粉涂抹所述待誘導(dǎo)花朵的柱頭并用10mg/L的2，4-D溶液處理所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁完成誘導(dǎo)得到誘導(dǎo)花朵，收獲誘導(dǎo)花朵所結(jié)的種子得到無融合生殖的亞麻種子；所述亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻new1為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代；所述亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代。
【專利說明】獲得無融合生殖亞麻種子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獲得無融合生殖亞麻種子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]無融合生殖是指不經(jīng)過精卵融合即可繁殖后代的一種生殖方式，是以無性生殖的方式產(chǎn)生種子的過程。無融合生殖由于其具有固定雜種優(yōu)勢、加速育種進(jìn)程、積累優(yōu)良基因的優(yōu)勢，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及遺傳育種上具有重要的意義和潛力[吳曼等，2010]。盡管目前已在被子植物52個科的400多種植物中發(fā)現(xiàn)了無融合生殖植物，但作物中普遍缺乏無融合生殖特性[郝建華等，2009]。自然界中植物無融合生殖常伴隨著有性生殖發(fā)生，在一定條件下，即使專性無融合生殖后代中也偶爾出現(xiàn)有性生殖后代[Nogler，1984]，兼性無融合生殖體的有性胚與無性胚的比率也會受到外界環(huán)境因素如光周期、溫度、無機(jī)鹽以及營養(yǎng)水平的影響[郝建華等，2009]。開展可以達(dá)到人工誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制無融合生殖發(fā)生的工作，獲得由無融合生殖產(chǎn)生的種子，可以簡化育種中長期艱難的選擇過程。
[0003]亞麻是自花授粉作物，育種周期較長，采用常規(guī)雜交方法育成一個品種需10?15年的時間。在亞麻的栽培種(Linum usitatissimum L.)內(nèi)存在極少部分的多胚種質(zhì)[康慶華，2004 ;康慶華等，2011]。這種多胚種質(zhì)一般表現(xiàn)為雙胚的發(fā)生，并且其中的一個胚通常是通過無融合生殖途徑產(chǎn)生，即胚囊的配子體細(xì)胞不經(jīng)受精而發(fā)育成胚胎個體，多數(shù)為單倍體，少數(shù)為純合二倍體或鑲嵌體。目前在已經(jīng)檢測過的材料中還沒有發(fā)現(xiàn)通過珠被細(xì)胞經(jīng)無性生殖產(chǎn)生的母體體細(xì)胞克隆。因此，在亞麻育種上，可利用無融合生殖進(jìn)行單倍體育種，其產(chǎn)生的非受精 胚經(jīng)篩選后進(jìn)行表型選擇。由于栽培種亞麻(Linum usitatissimumL.)內(nèi)無融合生殖頻率極低，為提高無融合生殖率，獲得僅由無融合生殖產(chǎn)生的后代對育種十分有利。
[0004]栽培種亞麻(Linum usitatissimum L.) H04052是2004年黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所采用自創(chuàng)的多胚品系與本所育成品種黑亞13號雜交選擇育成的種質(zhì)，該材料多胚率為0.5%?9% (康慶華等.多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用.中國麻業(yè)科學(xué).179-201.2011 年第 33 卷第 4 期)。栽培種亞麻(Linum usitatissimum L.) new I (劉巖等.土壤外源重金屬鉻對亞麻形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2012,40 (31):15167-15168)為2006年由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所從荷蘭引進(jìn)的高纖、抗倒纖維亞麻資源，在該所內(nèi)經(jīng)過三年擴(kuò)繁和鑒定，原莖、全麻、種子產(chǎn)量分別達(dá)到5063.3公斤/公頃、1080.8公斤/公頃和714.0公斤/公頃；長麻率22.0%，全麻率30.3%。栽培種亞麻(Linum usitatissimum L.)H09052是2009年黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所采用從俄羅斯引進(jìn)的多胚資源與自創(chuàng)的雙單倍體品系進(jìn)行雜交選擇育成的種質(zhì)，該材料多胚率為
5.56% (康慶華等.多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用.中國麻業(yè)科學(xué).179-201.2011年第33卷第4期)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是獲得無融合生殖亞麻種子的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的獲得無融合生殖亞麻種子的方法，包括以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交，得到雜交當(dāng)代所結(jié)的種子，將所述雜交當(dāng)代所結(jié)的種子進(jìn)行種植培育至開花，去除花藥未成熟(開放前一天)花朵的所有花藥得到待誘導(dǎo)花朵，用亞麻失活花粉涂抹所述待誘導(dǎo)花朵的柱頭，并用10mg/L的2，4-D溶液處理所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁完成誘導(dǎo)得到誘導(dǎo)花朵，收獲所述誘導(dǎo)花朵所結(jié)的種子得到無融合生殖的亞麻種子;
[0007]所述亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻newl為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代；
[0008]所述亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代。
[0009]上述方法中，用10mg/L的2，4_D溶液處理所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁完成誘導(dǎo)具體可為向所 述待誘導(dǎo)花朵的子房壁滴注10mg/L的2，4-D溶液。
[0010]在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，用10mg/L的2，4-D溶液處理所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁完成誘導(dǎo)的方法為向所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁連續(xù)5天滴注10mg/L的2，4-D溶液，每天I次，每次0.5ml。
[0011]上述方法中，所述亞麻失活花粉是對來源于所述待誘導(dǎo)花朵所在植株的花粉進(jìn)行滅活得到的沒有活力的花粉。
[0012]上述方法中，所述亞麻失活花粉可按照包括如下步驟的方法制備:收集所述待誘導(dǎo)花朵所在植株的花粉，用體積百分比濃度為70%的乙醇水溶液浸泡14小時，除去乙醇得到失活花粉。
[0013]2，4-D在制備亞麻無融合生殖誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]該應(yīng)用中，所述亞麻為以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交，得到的雜交第一代；
[0015]所述亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻newl為父本進(jìn)行雜交得到雜種第一代；所述亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到雜種第一代。
[0016]實(shí)驗(yàn)證明，10mg/L的2，4-D溶液可以在沒有受精作用的情況下誘導(dǎo)亞麻H2011017無融合生殖，亞麻H2011017可做為亞麻無融合生殖種質(zhì)的被選材料提供給育種者。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0018]下述實(shí)施例中的亞麻H04052 (康慶華等.多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用.中國麻業(yè)科學(xué).179-201.2011年第33卷第4期)、H09052 (康慶華等.多胚亞麻種質(zhì)的研究與利用.中國麻業(yè)科學(xué).179-201.2011年第33卷第4期)、newl (劉巖等.土壤外源重金屬鉻對亞麻形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2012，40 (31):15167-15168)，公眾可從黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所獲得，以重復(fù)本申請實(shí)驗(yàn)。[0019]實(shí)施例1、獲得無融合生殖亞麻種子
[0020]1.1試驗(yàn)材料
[0021]供試的亞麻材料有兩個，分別是H2011017和H2011044。
[0022]H2011017是以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交得到的雜交當(dāng)代所結(jié)的種子及由它所長成的植株。H2011044以亞麻H2010020為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜交當(dāng)代所結(jié)的種子及由它所長成的植株。
[0023]其中，亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻newl為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代；亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代；亞麻H2010020是以亞麻newl為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代。
[0024]1.2試驗(yàn)方法
[0025]試驗(yàn)在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院智能溫室及盆栽場進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)方法如下:
[0026]選取H2011017的60粒健康飽滿的種子(以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交得到的雜交當(dāng)代所結(jié)的種子)、H2011044的60粒健康飽滿的種子(以亞麻H2010020為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜交當(dāng)代所結(jié)的種子)種植于盆內(nèi)，生育前期放置于智能溫室培養(yǎng)，后期搬置于盆栽場，整個生育期給以充足的水分及營養(yǎng)。溫室晝夜溫度:春季22/15±5°C ;夏季25/20±5°C。晝夜光照:16/8。
[0027]在亞麻初花期，選取第二天能夠正常開花的花蕾去除所有雄蕊，套袋隔離，得到待誘導(dǎo)花朵。第二天早晨5:30-7 :30用亞麻失活花粉對待誘導(dǎo)花朵的柱頭涂抹授粉，然后對子房壁進(jìn)行生長調(diào)節(jié)劑滴注處理，連續(xù)滴注5天，每天早晨5:30-7:30滴注I次，每次0.5ml生長調(diào)節(jié)劑溶液，進(jìn)行無融合生殖誘導(dǎo)。試驗(yàn)采用的生長調(diào)節(jié)劑分為12種處理:不同濃度的ΝΑΑ(α-萘乙酸)溶液處理(N-l、Ν_2、Ν_3和Ν_4)、不同濃度的KT(激動素，6-糠氨基嘌呤)溶液處理(Κ-1、Κ-2、Κ-3和Κ-4)、不同濃度的2，4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)溶液處理(D-l、D-2、D-3和D-4)，各處理的相應(yīng)生長調(diào)節(jié)劑溶液的濃度分別如表I所示。同時設(shè)三種對照處理組:去雄后用失活花粉授粉，并用清水代替生長調(diào)節(jié)劑對子房進(jìn)行滴注處理(CKl);去雄后不做任何處理(CK2);正常自花授粉，不做處理(CK3)。授粉3天后開始調(diào)查蒴果膨大情況。生長調(diào)節(jié)劑處理組及對照處理組的蒴果都在成熟期收獲，并調(diào)查蒴果和種子產(chǎn)生情況，統(tǒng)計(jì)各處理總花朵數(shù)的成果數(shù)(成果標(biāo)準(zhǔn):各處理蒴果成熟時體積大于或等于1/2本株正常自花授粉蒴果成熟時體積)、各處理總花朵數(shù)的結(jié)籽粒數(shù)(結(jié)籽的標(biāo)準(zhǔn):成果內(nèi)所獲得的種子與本株正常自花授粉所得蒴果內(nèi)的種子在飽滿度、尺寸大小上相當(dāng))、坐果率％=每個處理總花朵的成果數(shù)/該處理總花朵數(shù)X 100 ;結(jié)籽率％=每個處理總花朵數(shù)的結(jié)籽粒數(shù)/該處理總花朵數(shù)XIOX 100。
[0028]其中，H2011017的待誘導(dǎo)花朵采用的亞麻失活花粉來自H2011017的待誘導(dǎo)花朵所在的植株，H2011044的待誘導(dǎo)花朵采用的亞麻失活花粉來自H2011044的待誘導(dǎo)花朵所在的植株。亞麻失活花粉的制備方法如下:收集亞麻待誘導(dǎo)花朵所在植株的花粉，用體積百分比濃度為70%的乙醇水溶液浸泡14小時，純凈水沖洗除去乙醇后800rpm/min離心5分鐘收集沉淀得到亞麻失活花粉。
[0029]上述方法中，H2011017和 H2011044 均在 N_l、N_2、N_3、N-4、Κ_1、Κ_2、Κ_3、K-4、D-l、D-2、D-3、D-4、CKl和CK2這14種處理中，每個處理各進(jìn)行3株，每株均全部誘導(dǎo)7個花朵進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。CK3中，H2011017和H2011044各選5朵自花授粉花朵進(jìn)行檢測。
[0030]表1.12種生長調(diào)節(jié)劑處理所采用的生長調(diào)節(jié)劑溶液及其濃度
[0031]
【權(quán)利要求】
1.獲得無融合生殖亞麻種子的方法，包括以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交，得到雜交當(dāng)代所結(jié)的種子，將所述雜交當(dāng)代所結(jié)的種子進(jìn)行種植培育至開花，去除花藥未成熟花朵的所有雄蕊得到待誘導(dǎo)花朵，用亞麻失活花粉涂抹所述待誘導(dǎo)花朵的柱頭并用10mg/L的2，4-D溶液處理所述待誘導(dǎo)花朵的子房壁完成誘導(dǎo)得到誘導(dǎo)花朵，收獲所述誘導(dǎo)花朵所結(jié)的種子得到無融合生殖的亞麻種子； 所述亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻newl為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代； 所述亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到的雜種第一代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述亞麻失活花粉是對來源于所述待誘導(dǎo)花朵所在植株的花粉進(jìn)行滅活得到的沒有活力的花粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述亞麻失活花粉按照包括如下步驟的方法制備:收集所述待誘導(dǎo)花朵所在植株的花粉，用體積百分比濃度為70%的乙醇水溶液浸泡14小時，除去乙醇得到失活花粉。
4.2，4-D在制備亞麻無融合生殖誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述亞麻為以亞麻H2010018為母本，以亞麻H2010049為父本進(jìn)行雜交，得到的雜交第一代； 所述亞麻H2010018是以亞麻H04052為母本，以亞麻newl為父本進(jìn)行雜交得到雜種第一代； 所述亞麻H2010049是以亞麻H04052為母本，以亞麻H09052為父本進(jìn)行雜交得到雜種第一代。
【文檔編號】A01H1/02GK103430831SQ201310355880
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月15日
【發(fā)明者】康慶華, 關(guān)鳳芝, 吳廣文, 黃文功, 江衛(wèi)東, 趙東升, 宋喜霞, 劉巖, 吳建忠, 程莉莉, 于瑩, 袁紅梅, 姚玉波, 路穎, 楊學(xué), 宋憲友, 王福亮, 孫中義, 徐涵 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所