一種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白基因及其抗重金屬應用的制作方法
【專利摘要】本發明將一種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白轉入植物并使得這種轉基因植物能夠具備增加植物抗重金屬的作用。所述重金屬結合蛋白基因按植物偏愛密碼合成含234個堿基，編碼的氨基酸73個；所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發明中來源于扭脫甲基桿菌的重簡化結合采用人工方法合成，轉基因植物具備較高的抗重金屬性。
【專利說明】一種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白基因及其抗重 金屬應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于遺傳育種領域，具體涉及一種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白 基因的序列，利用農桿菌將該基因轉化到植物中，使植物抗金屬能力得到提高。
【背景技術】
[0002] 隨著現代工農業的迅速發展、城市的急劇擴大，自然環境中的重金屬污染日益嚴 重。每年因重金屬污染帶來的糧食減產達1000多萬噸，被重金屬污染的糧食每年達1200 萬噸，年經濟損失在200億以上。傳統的土壤重金屬污染修復技術有排土填埋法、稀釋法、 淋洗法、物理分離法和化學法等因成本高、效率低，而且會破壞土壤結構，導致二次污染等 原因，難以大面積應用。
[0003] 與傳統的處理方式相比，植物修復的主要優點是成本低，處理設施簡單，適合大規 模的應用，利于土壤生態系統的保持，對環境擾動小，具有美學價值等特點。植物修復是生 物修復（bioremediation)的一種方式，又稱綠色修復（greenremediation)，是以植物忍 耐、分解或超量積累某種或某些化學元素的生理功能為基礎，利用植物及其共存微生物體 系來吸收、降解、揮發和富集環境中污染物的一項環境污染治理技術。
[0004] 然而，植物修復的關鍵核心問題在于修復的效率問題，本發明通過基因工程技術 提高植物修復的效率，從而希望能引領植物修復技術的新一輪發展。
[0005] 本項發明利用PTDS法合成了來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白基因，將該 基因轉化擬南芥，進而提高了轉基因擬南芥的耐重金屬能力，該基因對于培育植物抗重金 屬的植物品種非常重要，具有重要的理論意義和現實意義。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題在于將一種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白 基因轉入植物體內，并對該轉基因植物進行功能驗證，以證明它具有提高植物的抗重金屬 的功能。
[0007] -種來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP，其核苷酸序列如SEQIDN01 所示，其氨基酸序列如SEQIDN02所示。
[0008] 所述來源于扭脫甲基桿菌的根據植物偏愛人工合成的重金屬結合蛋白MaHMBP長 234bp，編碼的氨基酸73個。
[0009] 所述來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP通過農桿菌介導轉入擬南 芥，應用于植物抗重金屬性。
[0010] 所述來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP基因采用人工方法合成，具 體包括以下步驟：
[0011] 1)MaHMBP的人工合成
[0012] 依照PTDS(PCR_basedtwo-stepDNAsynthesis，PTDS)方法進行源自扭脫甲基桿 菌的重金屬結合蛋白基因進行化學合成，在保持MaHMBP基因的氨基酸序列不變的基礎上， 設計引物合成了MaHMBP基因。
[0013] 2)MaHMBP農桿菌雙元載體的構建
[0014]MaHMBP基因植物雙元載體在pcAMBIA-1301載體的基礎上構建而成，在 pCAMBIA-1301載體的多克隆位點處插入兩端附加了煙草的染色質附著SAR序列的外源基 因的表達單兀，這有利于轉基因的穩定遺傳；在外源基因的表達單兀內，我們在目的基因的 兩側導入了BamHI和Sacl酶切位點，便于外源基因的插入，外源基因的表達由雙CAMV355 啟動子+TMVomegaleadersequence控制
[0015] 3)電擊法轉化農桿菌
[0016] 參照MicroPulser?ElectroporationApparatusOperatingInstructionsand ApplicationGuide(BI〇-RAD公司）制備農桿菌GV3101感受態.并且將構建好的農桿菌雙 元載體經電擊法轉入到農桿菌中。
[0017] 4)農桿菌介導轉化擬南芥
[0018] 利用蘸花法將構建好的農桿菌轉入擬南芥體內.首先將擬南芥的花苔浸入滲透 液中，輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉化完畢后，托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋 套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室，低光強度下生長24小時，即可正常培養。生長 約兩個月后，收集種子，4 °C冰箱貯存待用。
[0019] 5)擬南芥轉化植株種子的篩選
[0020] 將得到的種子進行篩選，包括⑶S組織化學染色分析和轉基因陽性植株的PCR檢 測得到轉入MaHMBP基因的擬南芥。
[0021] 6)轉基因擬南芥抗重金屬性驗證
[0022] 將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個 星期。然后將野生型和轉基因培養皿小苗用于抗重金屬實驗。用500yM濃度的氯化鉻溶 液處理野生型和轉基因擬南芥株系。處理一周，結果顯示在500yM氯化鉻處理下野生型生 長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉基因株系抑制較小。結果說明MaHMBP基因明顯 提高了擬南芥的抗重金屬能力。
[0023] 本發明實現的有益效果
[0024] 本發明采用PTDS法合成了來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP基因， 為了進一步分析該基因在重金屬逆境中的作用與功能，我們比較了轉MaHMBP基因的擬南 芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結果表明，野生型和轉MaHMBP基因擬南芥植株 在表型上有很大的差異。結果顯示在500yM濃度的氯化鉻濃度培養基處理下野生型生長 明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉基因株系抑制較小。結果說明ENHX2基因明顯提 高了擬南芥的抗重金屬能力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1是用于擬南芥轉化的植物表達載體示意圖。
[0026] 圖2是獲得的轉MaHMBP基因擬南芥的⑶S染色圖。
[0027] 圖3是轉MaHMBP基因擬南芥與野生型擬南芥的抗重金屬表型圖。
【具體實施方式】
[0028] 以下結合附圖詳細描述本發明的技術方案。應當說明的是，所述實施例僅用以說 明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的 普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明 技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求范圍中。
[0029] 本發明所用的試驗材料及其來源包括：
[0030] 野生型擬南芥（Arabidopsisthaliana)生態型擬南芥Columbia, 23°C人工氣候 室培養，16h光照培養。
[0031] 克隆載體pMD-18-SimpleT、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、 10XPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學試劑都從美國西 格瑪化學公司和上海國藥化學試劑購買。ABIPRIAMBig-DyeTerminatorDNA測序試劑盒 購自美國應用系統公司。
[0032] 本發明所用的試劑若未明確指明，則均購自西格瑪-奧德里奇（Sigma-Aldrich)。
[0033] 本發明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書（J.薩 姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科學出版社。）
[0034] 實施例1
[0035] 扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP基因的人工合成
[0036] 根據Genbank登錄的扭脫甲基桿菌MaHMBP基因序列，用以基因合成方法【Nucleic AcidsResearch，2004, 32，e98】，在不改變基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原則進 行合成基因編碼區的設計：（一）優化基因密碼子，提高基因翻譯效率。（二）消除基因內 部的常用限制性內切酶的識別位點，便于表達盒構建。（三）消除逆向重復序列、莖環結構 和轉錄終止信號，使基因內部的GC/AT均衡，提高RNA的穩定性。（四）使基因編碼蛋白符 合N端原則（Tobiasl991)，以提高翻譯蛋白的穩定性。（五）設計提高基因5'端的自由能， 以提_基因翻譯起始效率。
[0037] 擴增條件為：941：預熱1111111;941：，3〇8,5〇1：，3〇8,721：，2111111，使用的1 &9〇嫩聚 合酶為KODFXtaq酶（Toyobo公司，日本），共25個循環。
[0038]PCR結束后，1%瓊脂糖膠回收，取lOiU直接與T/A克隆載體相連（大連寶生物公 司）。4°C連接過夜，高效轉化DH5a感受態中。獲得陽性克隆。
[0039] 實施例2
[0040] MaHMBP農桿菌雙元載體的構建
[0041] 上述人工合成的MaHMBP基因的陽性克隆用引物經PCR擴增后頭尾分別加入Bam HI和SacI切點，經BamHl+SacI雙酶切，回收DNA片段與相應酶切的載體相連，經酶切鑒 定和測序后得到正確的雙元載體（見圖1)。
[0042] 實施例3
[0043] 電擊法轉化農桿菌
[0044] 1)制備農桿菌GV3101 感受態，方法參照MicroPulser?Electroporation ApparatusOperatingInstructionsandApplicationGuide(BIO-RAD公司）（（Raineri etal. ,Bio.Tech. ,1990,8 :33_38)。
[0045]2)取50iiLGV3101感受態細胞，加入1iiLDNA，轉入0? 2cm電擊杯轉化（400Q， 2. 5KV，25iif)。加入lmL含有1 %甘露醇的LB培養基恢復培養2小時（28°C，250rpm)。分 別取10iiL、100iiL涂LB平板（利福平50iig/mL，慶大霉素50iig/nL，氯霉素100iig/mL)。
[0046] 3)挑取幾個克隆，堿法抽提農桿菌質粒，酶切鑒定，PCR檢測。
[0047] 實施例4
[0048] 農桿菌介導轉化擬南芥
[0049]A擬南芥的培養
[0050] 1)擬南芥種子在4°C進行2-3天的春化處理，目的是有利于種子的一致萌發和花 期的提前。
[0051] 2)將蛭石、黑土、珍珠巖按9 : 3 : 0.5的比例拌勻，經高溫滅菌后裝于10cm的塑 料小盆，以營養液PNS浸濕待用。
[0052] 3)以牙簽將擬南芥種子點播于濕潤的基質上，保鮮膜封口。放置于22°C暗培養 2-3天，待種子萌發后，揭開保鮮膜，置于22°C培養室中進行16小時光照培養。
[0053] 4)擬南芥抽苔后及抽苔后兩周以及轉化后需再以PNS營養液浸濕一次。中途可視 情況適當澆水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生長，當次生苔長至2-lOcm(少數 已經開花）可用于轉化（何玉科，鞏振輝，細跑生物學雜志，1991，13(3) :97-101)。
[0054] B農桿菌的準備
[0055] 1)挑取農桿菌單菌接種于5mLLB液體培養基（利福平50yg/mL，氯霉素100yg/ mL)中，28°C，25〇rpm培養 2〇 小時。（Rashidetal.，l"6)
[0056] 2)取lmL菌液轉接入20-30mLLB液體培養基（利福平50iig/mL，氯霉素100iig/ mL)中，28°C，250rpm培養約 12 小時，測 0D600 ?1. 5。
[0057] 3)8000印111，41：，10111111離心收集菌體，重懸于農桿菌轉化滲透液（5%蔗糖， 0? 05%SilwetL-77)并稀釋至 0D600 ?0? 8。
[0058] C擬南芥蘸花法轉化
[0059] 1)將擬南芥的花苔浸入滲透液中，輕輕攪動約3?5秒后取出，全部轉化完畢后， 托盤中加入PNS營養液，以黑色塑料袋套盆封口，保持濕潤環境，置于22°C培養室低光強度 下生長24小時，即可正常培養。
[0060] 2)初次轉化四天后，可再進行一次轉化，重復兩次，總共轉化三次，這樣可以在花 發育的不同時期進行轉化，提高轉化效率。
[0061] 3)生長約兩個月后，收集種子，4°C冰箱貯存待用。
[0062] 實施例5
[0063] 擬南芥轉化植株種子的篩選
[0064] 1)稱25_30mg種子放入1. 5mL離心管。
[0065] 2)lmL75%乙醇消毒lmin(不停搖晃振蕩），8000rpm離心5秒，去上清。
[0066] 3)加入lmL過濾后的漂白粉消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒），8000rpm離心 5秒，去上清。
[0067] 4)無菌水洗滌3-4次。
[0068] 5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板（Hyg50iig/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰箱 放置兩天，22°C，16小時光照培養6天。
[0069] 6)將抗性植株移栽到盆中培養，苗稍大后，進行GUS活性檢測，選出陽性植株（T1) 繼續培養，并收集種子進行T2代和T3代篩選。
[0070]實施例6
[0071] 轉基因陽性植株的檢測
[0072]按Jefferson(1978)的方法，將待測擬南芥葉片樣品與X-Gluc染色反應液（50m mol/LNaH2P04，pH7.0;0.5mmol/LK4[Fe(CN)6]，0.1%TritonX-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc[X-glucuronide])于37°C保溫2-4小時后，用75%乙醇脫色觀察（見圖2)。
[0073] 實施例7
[0074] 扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白MaHMBP基因轉化植物后的抗重金屬分析
[0075] 將轉化植物自交純合3代，獲得純合轉化株，收取種子。播種后，在22°C生長兩個 星期。然后比較了轉MaHMBP基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株的抗重金屬性。結果 表明，野生型和轉MaHMBP基因擬南芥植株在表型上有很大的差異。結果顯示在500yM濃 度的氯化鉻濃度培養基處理下野生型生長明顯受抑制，根系不生長，葉片稀少，而轉基因株 系抑制較小。結果說明MaHMBP基因明顯提高了擬南芥的抗重金屬能力（圖3)。
【權利要求】
1. 一種來源于扭脫甲基桿菌的根據植物偏愛人工合成的重金屬結合蛋白基因，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQ ID N01所示。
2. 根據權利要求1所述的來源于扭脫甲基桿菌的重金屬結合蛋白，其特征在于，其氨 基酸序列如SEQ ID N02所示。
3. 權利要求1或2所述的重金屬結合蛋白采用人工方法制備而成。
4. 權利要求1或2所述的重金屬結合蛋白采用農桿菌蘸花法轉化擬南芥。
5. 權利要求1或2所述的重金屬結合蛋白轉基因植物在抗重金屬中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104342446SQ201310348974
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年8月9日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】周惠, 苗輝, 蔣海燕, 張楊, 蔣小輝, 伍光彩 申請人:無錫柏歐美地生物科技有限公司