專利名稱：一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法
技術領域：
本發明涉及一種組織培養方法，具體涉及到一種平貝母的繁殖方法。
背景技術：
平貝母，別名平貝、北貝、貝母，為百合科多年生草本，高達lm。平貝母的干燥鱗莖是我國常用的中藥材，具有清熱潤肺、化痰止咳、散結等功能，在臨床上用于痰熱咳嗽、咳痰帶血、瘰疬瘡瘍腫毒等疾病的治療。近年來，由于過度采挖，資源逐年減少，商品供不應求，價格不斷上漲。目前對貝母的組織培養研究已經有了一定的規模，但是鑒于技術的問題一直存在著一些問題，對平貝母的快速繁殖技術也已經有一定的研究，但是對平貝母的需求日益增力口，目前平貝母的繁殖和種植遠遠達不到人們的需求，組織培養可以大大提高平貝母的繁殖率，但是目前組織培養體系尚未充分建立，存在一些技術上的問題，優良品種的推廣普及尚未完成，供求矛盾日益加劇，嚴重影響了平貝母的大量繁殖。
發明內容
本發明針對目前存在的問題，提供一種能夠快速、有效的利用現有資源繁殖平貝母的方法。為了解決上述 技術問題，本發明采用的一個技術方案是:
一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)外植體的選擇與消毒:首先選擇當年生長健壯、無霉爛斑點的新鮮平貝母，剪去根及有傷鱗片，流水沖洗30 min后放入清水中浸泡15min，再用50 %多菌靈500倍液浸泡2(T30 min或者用50%福美雙粉500倍液浸泡l(Tl5min，然后將種球鱗片剝下，用紫外燈照射10 min,轉入超凈工作臺，再用75%酒精消毒50 S，無菌水沖洗2 3次，再用6%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗2 3次。最后用0.2%的升汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗4 5次。(2)材料處理:首先在超凈工作臺上，在無菌條件下，切去鱗片上部1/3，然后將中、下部分割開來，將鱗片和鱗莖基部分別切成6-8mm的小塊；
(3)初代培養:在無菌的條件下將步驟(2)得到的外植體接種在初代培養基上，該培養基是在在3/4MS常規培養基中添加了 0.8mg/L的6_BA、1.2mg/L的NAA，30_40mg/L的蔗糖和0.4-0.8mg/L的ZT ；PH % 6.0,培養溫度為24°C，光照時間12 h/d，光照強度2 000 Lx,瓊脂5 g/L，經過25-30天形成愈傷組織；
(4)繼代培養:將初代培養的愈傷組織切下接種在繼代培養基上，該培養基是在MS常規培養基中添加了 0.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的ΙΒΑ、0.3mg/L的KT和20mg/L的蔗糖，PH
6.0，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，經過7_12天時間分化出綠點后，即開始下一階段；
(5)小鱗莖的增殖:將分化出綠點的愈傷組織繼續培養，該培養基是在1/2MS常規培養基中添加了 40mg/L 的蔗糖、0.3mg/L 的 KT、0.4mg/LNAA 和 0.2mg/L 的 ZT，PH 6.0,培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，經10-15天培養便可分化出叢生小鱗莖； (6)生根培養:將分化出來的小鱗莖接種于下列誘導培養基中進行生根誘導:1/2MS培養基、0.3mg/L的KT、lmg/L的活性炭、7_8g/L的瓊脂、0.5mg/L的NAA，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001UX，經過8-12天待小鱗莖長至2.5cm高，根系比較發達時，即開始下一個階段； (7)煉苗移栽:先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗6d，然后將長出新根的小鱗莖從培養瓶中取出，在陽光下曬1-2天，在曬的過程中要適當遮光，使光照強度為自然光的50%，溫度在15°C左右，當培養基表面成龜裂狀后，取出小苗洗凈根部附著的培養基，移栽到經消毒的腐殖土:草炭:珍珠巖:蛭石=2: 2: I:3 (重量比)的混合基質中，溫度控制在25°C左右。
本發明的有益效果主要體現在: (1)建立了完善的平貝母的離體組織培養快速繁殖的成套技術，達到了高效誘導外植體分化增殖目的，并且保存了母體的全部優良性狀，遺傳性狀穩定；(2)縮短了繁殖周期，在保證了成活率的基礎上，提高了繁殖效率，增加了經濟效益；(3)在不同的培養階段的利用不同的激素進行調節，對培養基配方的精確篩選達到試管苗生長旺盛的優良效果，并且結合有效的滅菌技術，達到提高增殖率和減少變異的目的。
(4)在繼代培養后的小鱗莖的增殖過程中適當更換了培養基，更有利于小鱗莖的快速生長。
(5)在移栽煉苗的過程中，采取必要的措施控制了生長的溫度和光照強度，使平貝母在適宜的溫度下進行繁殖，提高了幼苗的質量和成活率。
具體實施方式
下面對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特征能更易于被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。
實施例1 一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)外植體的選擇與消毒:首先選擇當年生長健壯、無霉爛`斑點的新鮮平貝母，剪去根及有傷鱗片，流水沖洗30 min后放入清水中浸泡15min，再用50 %多菌靈500倍液浸泡20min或者用50%福美雙粉500倍液浸泡lOmin，然后將種球鱗片剝下，用紫外燈照射10min,轉入超凈工作臺，再用75%酒精消毒50 S，無菌水沖洗2次，再用6%次氯酸鈉溶液消毒10 min,無菌水沖洗3次。最后用0.2%的升萊溶液消毒10 min,無菌水沖洗4次。
(2)材料處理:首先在超凈工作臺上，在無菌條件下，選擇外層鱗片的中部，切成6-8mm的小塊；(3)初代培養:在無菌的條件下將步驟(2)得到的外植體接種在初代培養基上，該培養基是在在3/4MS常規培養基中添加了 0.8mg/L的6_BA、1.2mg/L的NAA，30mg/L的蔗糖和0.4mg/L的ZT ；PH為6.0，培養溫度為24°C，光照時間12 h/d,光照強度2 OOO Lx,瓊脂5g/L,經過30天形成愈傷組織； (4)繼代培養:將初代培養的愈傷組織切下接種在繼代培養基上，該培養基是在MS常規培養基中添加了 0.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的ΙΒΑ、0.3mg/L的KT和20mg/L的蔗糖，PH6.0，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，經過12天時間分化出綠點后，即開始下一階段； (5)小鱗莖的增殖:將分化出綠點的愈傷組織繼續培養，該培養基是在1/2MS常規培養基中添加了 40mg/L 的蔗糖、0.3mg/L 的 KT、0.4mg/LNAA 和 0.2mg/L 的 ZT，PH 6.0,培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001UX，經15天培養便可分化出叢生小鱗莖； (6)生根培養:將分化出來的小鱗莖接種于下列誘導培養基中進行生根誘導:1/2MS培養基、0.3mg/L的KT、lmg/L的活性炭、7g/L的瓊脂、0.5mg/L的NAA，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001UX，經過12天待小鱗莖長至2.5cm高，根系比較發達時，即開始下一個階段； (7)煉 苗移栽:先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗6d，然后將長出新根的小鱗莖從培養瓶中取出，在陽光下曬2天，在曬的過程中要適當遮光，使光照強度為自然光的50%，溫度在15°C左右，當培養基表面成龜裂狀后，取出小苗洗凈根部附著的培養基，移栽到經消毒的腐殖土:草炭:珍珠巖:蛭石=2: 2: I:3 (重量比)的混合基質中，溫度控制在25°C左右。
實施例2 將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇外層鱗片的下部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過27天形成愈傷組織，在繼代培養中經過9天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過12天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過11天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。
實施例3 將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇外層鱗片的下部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過27天形成愈傷組織，在繼代培養中經過8天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過12天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過10天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。
實施例4 將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇中層鱗片的中部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過28天形成愈傷組織，在繼代培養中經過10天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過11天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過10天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。
實施例5 將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇中層鱗片的下部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過26天形成愈傷組織，在繼代培養中經過9天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過13天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過10天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。
實施例6 將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇內層鱗片的中部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過27天形成愈傷組織，在繼代培養中經過10天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過12天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過9天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。實施例7
將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇內層鱗片的下部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過25天形成愈傷組織，在繼代培養中經過7天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過10天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過8天小鱗莖長至2.5cm，根系比較發達。實施例8
將步驟(2)材料處理過程中的材料選擇鱗片的基部，其余條件與實施例1相同，結果在初代培養中經過26天形成愈傷組織，在繼代培養中經過8天時間分化出綠點，在小鱗莖的增殖過程中經過12天培養可分化出叢生小鱗莖，在生根培養過程中經過10天小鱗莖長至2.5cm,根系比較發達。通過實施例1至實施例8的對比發現，內層鱗片的下部是平貝母進行組織培養的最佳材料。實施例9
一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，其特征在于，包括以下步驟: (I)外植體的選擇與消毒:首先選擇當年生長健壯、無霉爛斑點的新鮮平貝母，剪去根及有傷鱗片，流水沖洗30 min后放入清水中浸泡15min，再用50%多菌靈500倍液浸泡30min或者用50%福美雙粉500倍液浸泡15min，然后將種球鱗片剝下，用紫外燈照射10 min,轉入超凈工作臺，再用75%酒精消毒50 S，無菌水沖洗3次，再用6%次氯酸鈉溶液消毒10min,無菌水沖洗3次。最后用0.2%的升萊溶液消毒10 min,無菌水沖洗5次。(2)材料處理:首先在超凈工作臺上，在無菌條件下，選擇內層鱗片的下部切成6-8mm的小塊；
(3)初代培養:在無菌的條件下將步驟(2)得到的外植體接種在初代培養基上，該培養基是在在3/4MS常規培養基中添加了 0.8mg/L的6_BA、1.2mg/L的NAA，40mg/L的蔗糖和
0.8mg/L的ZT ;培養溫度為24°C，光照時間12 h/d，光照強度2 000 Lx, PH為6.5，瓊脂5g/L，經過25天形成愈傷組織；
(4)繼代培養:將初代培養的愈傷組織切下接種在繼代培養基上，該培養基是在MS常規培養基中添加了 0.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的IBA、0.3mg/L的KT和20mg/L的蔗糖，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，PH 6.5，經過12天時間分化出綠點后，即開始下一階段；
(5)小鱗莖的增殖:將分化出綠點的愈傷組織繼續培養，該培養基是在1/2MS常規培養基中添加了 40mg/L的蔗糖、0.3mg/L的KT、0.4mg/LNAA和0.2mg/L的ZT，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，PH 6.5，經10天培養便可分化出叢生小鱗莖；
(6)生根培養:將分化出來的小鱗莖接種于下列誘導培養基中進行生根誘導:1/2MS培養基、0.3mg/L的KT、lmg/L的活性炭、8g/L的瓊脂、0.5mg/L的NAA，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001UX，經過10天待小鱗莖長至2.5cm高，根系比較發達時，即開始下一個階段；
(7)煉苗移栽:先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗6d，然后將長出新根的小鱗莖從培養瓶中取出，在陽光下曬2天，在曬的過程中要適當遮光，使光照強度為自然光的60%，溫度在18°C左右，當培養基表面成龜裂狀后，取出小苗洗凈根部附著的培養基，移栽到經消毒的腐殖土:草炭:珍珠巖:蛭石=2: 2: 1:3 (重量比)的混合基質中，溫度控制在15°C左右。
以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在 本發明的專利保護范圍內。
權利要求
1.一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)外植體的選擇與消毒:首先選擇當年生長健壯、無霉爛斑點的新鮮平貝母，剪去根及有傷鱗片，流水沖洗30 min后放入清水中浸泡15min，再用50 %多菌靈500倍液浸泡2(T30 min或者用50%福美雙粉500倍液浸泡l(Tl5min，然后將種球鱗片剝下，用紫外燈照射10 min,轉入超凈工作臺，再用75%酒精消毒50 S，無菌水沖洗2 3次，再用6%次氯酸鈉溶液消毒10 min，無菌水沖洗2 3次,最后用0.2%的升汞溶液消毒10 min，無菌水沖洗4 5次； (2)材料處理:首先在超凈工作臺上，在無菌條件下，切去鱗片上部1/3，然后將中、下部分割開來，將鱗片和鱗莖基部分別切成6-8mm的小塊； (3)初代培養:在無菌的條件下將步驟(2)得到的外植體接種在初代培養基上，該培養基是在在3/4MS常規培養基中添加了 0.8mg/L的6_BA、1.2mg/L的NAA，30_40mg/L的蔗糖和0.4-0.8mg/L的ZT ;培養溫度為24°C，光照時間12 h/d，光照強度2 000 Lx7PH為6.5，瓊脂5 g/L，經過25-30天形成愈傷組織； (4)繼代培養:將初代培養的愈傷組織切下接種在繼代培養基上，該培養基是在MS常規培養基中添加了 0.5mg/L的6-BA、0.3mg/L的IBA、0.3mg/L的KT和20mg/L的蔗糖，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001ux，PH 6.5，經過7_12天時間分化出綠點后，即開始下一階段； (5)小鱗莖的增殖:將分化出綠點的愈傷組織繼續培養，該培養基是在1/2MS常規培養基中添加了 40mg/L的蔗糖、0.3mg/L的KT、0.4mg/LNAA和0.2mg/L的ZT，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光 強度為22001ux，PH 6.5，經10-15天培養便可分化出叢生小鱗莖； (6)生根培養:將分化出來的小鱗莖接種于下列誘導培養基中進行生根誘導:1/2MS培養基、0.3mg/L的KT、lmg/L的活性炭、7_8g/L的瓊脂、0.5mg/L的NAA，培養溫度為24°C，光照周期13h/d，光強度為22001UX，經過8-12天待小鱗莖長至2.5cm高，根系比較發達時，即開始下一個階段； (7)煉苗移栽:先將培養瓶移至溫室，自然條件下煉苗6d，然后將長出新根的小鱗莖從培養瓶中取出，在陽光下曬1-2天，在曬的過程中要適當遮光，使光照強度為自然光的60%，溫度在18°C左右，當培養基表面成龜裂狀后，取出小苗洗凈根部附著的培養基，移栽到經消毒的腐殖土:草炭:珍珠巖:蛭石=2: 2: I:3 (重量比)的混合基質中，溫度控制在15°C左右。
2.根據權利要求1所述的一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，其特征在于，所述的鱗片繁殖材料最佳選擇為內層鱗片的下部。
全文摘要
本發明公開了一種利用組織培養技術繁殖平貝母的方法，主要包括外植體的選擇與消毒、材料處理、初代培養、繼代培養、小鱗莖的增殖、生根培養和煉苗移栽等步驟。在不同的培養階段的利用不同的激素進行調節，對培養基配方的精確篩選達到試管苗生長旺盛的優良效果，并且結合有效的滅菌技術，達到提高增殖率和減少變異的目的。并且在繼代培養后的小鱗莖的增殖過程中適當更換了培養基，更有利于小鱗莖的快速生長。并且通過鱗片不同部位的比較發現，鱗片繁殖材料最佳選擇為內層鱗片的下部。
文檔編號A01G1/00GK103238525SQ201310211909
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月31日 優先權日2013年5月31日
發明者陳勇明 申請人:常熟市佳盛農業科技發展有限公司