具有抑制反芻動(dòng)物胃內(nèi)甲烷生成的機(jī)能的微生物及其利用的制作方法

具有抑制反芻動(dòng)物胃內(nèi)甲烷生成的機(jī)能的微生物及其利用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及作為還原性產(chǎn)乙酸菌，具有抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成機(jī)能Proteiniphilum?acetatigenes?SROD-1（KCCM11219P）及利用其的方法。將包括本發(fā)明的Proteiniphilum?acetatigenes?SROD-1的微生物制劑直接供給反芻動(dòng)物或使反芻動(dòng)物攝取包括所述微生物制劑的牲畜用飼料時(shí)，可以抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成。此外，對于人體或動(dòng)物的危害小、安全，并且根本性地減少作為地球溫室化主要原因的甲烷，并增加飼料的利用效率，因此其效用價(jià)值非?？捎^。
【專利說明】具有抑制反芻動(dòng)物胃內(nèi)甲烷生成的機(jī)能的微生物及其利用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作為還原性產(chǎn)乙酸菌的具有抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成機(jī) 能的微生物、包括其的微生物制劑及包括所述微生物制劑的牲畜飼料。此外，本發(fā)明涉及通 過讓動(dòng)物攝取還原性產(chǎn)乙酸菌，從而抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著大氣中的溫室氣體增加加劇了地球溫室化。其結(jié)果導(dǎo)致了地球平均 溫度與海平面的上升，并且導(dǎo)致發(fā)生了沙漠化、干旱、洪水、臺(tái)風(fēng)等的氣象異變。甲烷是引發(fā) 這種異常天氣的原因之一，相比于二氧化碳，甲烷具有約24倍左右的溫室效果能力，因此 對地球的溫室化產(chǎn)生了很大的影響。
[0003] 另一方面，畜牧業(yè)作為繁殖并養(yǎng)殖家畜來供給食用肉的農(nóng)業(yè)的一個(gè)分支，是向人 們提供肉類、皮革等的國家的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)。但是，因?yàn)槿藗儗Φ厍驕厥一瘑栴}等的關(guān)注度的增 力口，導(dǎo)致加重了人們對經(jīng)營畜牧業(yè)期間所發(fā)生的甲烷及其相關(guān)問題的顧慮。反芻動(dòng)物消化 食物的過程中所產(chǎn)生的甲烷作為畜舍中產(chǎn)生甲烷的重大原因，因此人們越來越關(guān)注對如何 減少該甲烷生成。
[0004] 抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)甲烷生成的方法大體可分為兩種。第一種方法為使用 可以利用氫的如硝酸鹽或亞硝酸鹽的化合物，來控制作為甲烷生成的先導(dǎo)物質(zhì)的氫的發(fā)生 量，但是這種情況下，會(huì)產(chǎn)生對細(xì)胞所需的氧氣供給不足的顧慮。
[0005] 另一種方法為使用作為對產(chǎn)甲烷微生物具有毒性的化合物的離子載體 (ionophore)或抗生素等，但是在長期服用時(shí)會(huì)存在因產(chǎn)甲烷微生物對其產(chǎn)生適應(yīng)性導(dǎo)致 抑制甲烷生成的效果降低的問題。此外，上述的方法均為利用化合物的方法，因此在上述物 質(zhì)殘留于畜牧體內(nèi)時(shí)會(huì)存在食用安全性問題，并且還會(huì)同時(shí)抑制反芻胃內(nèi)的有益的微生 物的生長，因此存在使飼料利用效率低下且生產(chǎn)性弱化的問題。
[0006] 關(guān)于抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法，韓國公開專利 10-2006-0019062號(hào)公開了包括選自生姜、韭菜提取物及共軛亞油酸中的任意一種以上 的選擇性地減少反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的原生動(dòng)物（protozoa)的飼料混料，韓國公開專 利10-2007-0033968號(hào)公開了用于改善對反芻胃的發(fā)酵產(chǎn)生影響的反芻動(dòng)物的能量及蛋 白質(zhì)油脂的植物提取物，韓國公開專利10-2011 -0119370號(hào)公開了包括35至45重量％ 的濃厚飼料、35至45重量％的梯牧草（timothy)及10至30重量％的稻草的用于抑制 反芻動(dòng)物的溫室氣體生成量的飼料混料及反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)方法。此外，韓國公開專利特 2002-0042866號(hào)公開了多環(huán)醌（Polycyclic quinone)及離子載體化合物的用于減少反芻 動(dòng)物的甲烷生成的混料，韓國公開專利10-2011-0036470號(hào)公開了包括蒜的用于降低反芻 動(dòng)物的甲烷生成的飼料，韓國公開專利10-2011-0039540號(hào)公開了利用限制含有除了動(dòng)物 源性的所有脂肪以外的飽和脂肪酸的植物性油的外源性攝入的方法等來減少并調(diào)節(jié)擠奶 用反芻動(dòng)物所生成的甲烷量的方法。此外，韓國公開專利特1995-7004060號(hào)公開了利用 蒽醌（Anthraquinone)的抑制反芻動(dòng)物的甲燒生成的方法，日本公開專利特開2003-88301 號(hào)公開了以選自乳酸菌、酵母及寡糖構(gòu)成的群中的至少一種以上作為技術(shù)特征的用于抑 制反芻動(dòng)物的甲烷生成的混料，日本公開專利特開2002-281912號(hào)以含有選自桉樹油、薄 荷油、芥末油、桉葉素、碘及環(huán)糊精包接合物中的至少一種以上作為技術(shù)特征的反芻動(dòng)物 用甲烷生成抑制劑及飼料混料，日本公開專利特開平11-46694號(hào)公開了以含有富馬酸 (fumaric)作為技術(shù)特征的反芻動(dòng)物的甲燒生成抑制劑及飼料混料。但是未公開利用本發(fā) 明的Proteiniphilum屬的微生物來抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲燒生成的方法。
[0007] 對此，本發(fā)明試圖開發(fā)一種微生物，實(shí)現(xiàn)人們一直致力于開發(fā)抑制反芻動(dòng)物的反 芻胃內(nèi)生成作為根本性溫室氣體之一的甲烷的生成，來防止地球溫室化、增大飼料利用效 率并且在抑制甲烷生成的過程中不會(huì)對人體或動(dòng)物產(chǎn)生害處。終其結(jié)果，從家畜的反芻胃 中分離的微生物中發(fā)現(xiàn)了新的微生物，且確認(rèn)到了該微生物會(huì)有效地與產(chǎn)甲烷微生物進(jìn)行 基質(zhì)競爭并生成乙酸從而來抑制甲烷的生成，由此來完成的本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] (要解決的技術(shù)問題）
[0009] 本發(fā)明是為了在根本上去除或減少作為地球溫室化的原因之一、且會(huì)降低飼料利 用效率的甲烷而創(chuàng)出，其一目的在于提供作為還原性產(chǎn)乙酸菌的抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi) 的甲燒生成的微生物的 Proteiniphilum acetatig enes SR0D-1。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供，以包括所述微生物作為技術(shù)特征的用于抑制反芻動(dòng) 物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的微生物制劑。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供，以包括所述微生物制劑作為技術(shù)特征的用于抑制反 芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的牲畜用飼料。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供，通過讓動(dòng)物攝取還原性產(chǎn)乙酸菌，從而抑制反芻動(dòng) 物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法。
[0013] (解決問題的手段）
[0014] 本發(fā)明為了解決如上所述的技術(shù)問題，提供具有抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷 生成的Proteiniphilum屬的還原性產(chǎn)乙酸菌及其用途。
[0015] 作為還原性產(chǎn)乙酸菌，最優(yōu)選為使用本發(fā)明人們所分離并鑒定的Prot einiphilum acetatigenes SR0D-1 (KCCM11219PP)。
[0016] 此外，本發(fā)明作為具有抑制所述反芻胃內(nèi)的甲燒生成機(jī)能的Proteinip hilum屬 的還原性產(chǎn)乙酸菌的一用途，提供包括Proteiniphilum屬的還原性產(chǎn)乙酸菌的用于抑制 反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的微生物制劑。
[0017] 此外，作為另一方案，提供牲畜用飼料，包括：所述還原性產(chǎn)乙酸菌或包括其的微 生物制劑。
[0018] 作為又另一方案，提供使動(dòng)物攝取所述還原性產(chǎn)乙酸菌或包括其的微生物制劑來 抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法。此時(shí)，所述給予可以由，將包括所述還原性產(chǎn) 乙酸菌的微生物制劑或者將包括所述微生物制劑的牲畜用飼料供給給反芻動(dòng)物的形態(tài)來 實(shí)現(xiàn)。
[0019] 關(guān)于這樣的具有抑制所述反芻胃內(nèi)的甲燒生成機(jī)能的Proteiniphilum屬的還 原性產(chǎn)乙酸菌有多種可以利用，最優(yōu)選為使用Proteiniphilum aceta tigenes) SR0D-1 (KCCM11219PP)。
[0020] (發(fā)明的效果）
[0021] 本發(fā)明的 Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1 (KCCM11219PP)是從傳統(tǒng)山羊 的反芻胃中分離而得，因此相比于使用化學(xué)性方法來抑制甲烷生成，其對人體或動(dòng)物的危 害性小且安全，并且通過還原性產(chǎn)乙酸菌從根本上減少了甲烷生成的原因，因此其效用價(jià) 值將相當(dāng)可觀。此外，利用所述微生物來制造微生物制劑及家畜用飼料等時(shí)，可以獲得額外 的經(jīng)濟(jì)效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是表示利用作為還原性產(chǎn)乙酸菌特征基因的FTHFS引子進(jìn)行的瓊脂糖凝膠電 泳的結(jié)果的照片。
[0023] 圖2是表示用于確認(rèn)本發(fā)明中篩選的作為還原性產(chǎn)乙酸菌的DA02、GA01、GA02及 GA03的系統(tǒng)學(xué)性所屬的系統(tǒng)樹圖。
[0024] 圖3及圖4是表示in vitro (體外）發(fā)酵過程中，在淀粉基質(zhì)下與酪蛋白 基質(zhì)下的乙酸生成的圖表[E. limosum-Eubacterium limosum ATCC8486 (對照組)， AY4226(DA02-Proteiniphilum acetatigenes TB107C99%)),AY4226(GA01-Proteiniphilum acetatigenes TB107 (98%)), AF742226 (G A02-Alkaliphilus crotonatoxidans Bll-2 (99%)), AY4226 (GA03-Proteini philum acetatigenes TB107 (99%)) ]〇
[0025] 圖5是表示使用淀粉作為基質(zhì)時(shí)，作為還原性產(chǎn)乙酸菌的DA02、GAO 1、GA02及GA03 的揮發(fā)性脂肪酸含量的圖。
[0026] 圖6是表示使用酪蛋白作為基質(zhì)時(shí)，作為還原性產(chǎn)乙酸菌的DA02、GA01、GA02及 GA03的揮發(fā)性脂肪酸含量的圖。
[0027] 圖7是表示通過in vitro分析方法確認(rèn)利用作為還原性產(chǎn)乙酸菌的G A03的甲 烷發(fā)生量的降低效果的圖。
[0028] 圖8是表示使用淀粉作為基質(zhì)時(shí)，作為還原性產(chǎn)乙酸菌的DA02、GAO 1、GA02及GA03 的抑制甲烷生成程度的圖。
[0029] 圖9是表示使用酪蛋白作為基質(zhì)時(shí)，作為還原性產(chǎn)乙酸菌的DA02、GA01、GA02及 GA03的抑制甲烷生成程度的圖。
[0030] 圖10是表示通過in vitro分析方法測量利用作為還原性產(chǎn)乙酸菌的G A3及呼 吸室的甲烷生成量的結(jié)果的圖。
[0031] (微生物保藏信息）
[0032] 生物材料拉丁文學(xué)名：Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1
[0033] 生物材料中文分類名：普羅特因費(fèi)勒屬阿塞特體基恩菌
[0034] 保藏日期：2011年11月9日
[0035] 保藏單位：韓國微生物保藏中心（Korean Culture Center of Microorganis ms) 保藏單位地址：韓國首爾市 保藏編號(hào)：KCCM11219P

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面對本發(fā)明中所使用的用語進(jìn)行定義。
[0037] 本發(fā)明中使用的"動(dòng)物"或"實(shí)驗(yàn)動(dòng)物"是指人類以外的任意的哺乳類動(dòng)物，特別 是指"反芻動(dòng)物"。"反芻動(dòng)物（ruminants ) "作為屬于哺乳目的動(dòng)物，亦稱之為反芻亞目動(dòng) 物。常見于駱駝科、鹿科、長頸鹿科、牛科的動(dòng)物中。這類動(dòng)物具有第一胃到第四胃的復(fù)胃， 具有與豬等的單胃動(dòng)物截然不同的消化結(jié)構(gòu)，如上所述的多個(gè)胃稱之為反芻胃。反芻胃由 用于放置所食的食物的大的第一胃（瘤胃：rumen)、具有如蜂巢模樣的胃壁的第二胃（蜂巢 胃：reticulum)、粘膜形成為褶皺模樣的第三胃（瓣胃 ：〇ma sum)及分布有胃腺的第四胃（皺 胃：abomasum)等的四個(gè)房構(gòu)成。所述動(dòng)物包括胚胎、胎兒、新生兒和成年的所有年齡層的 動(dòng)物。
[0038] "飼料混料"是適合用作動(dòng)物飼料，是指多種天然或非天然基（non-natural base) 或未加工的物質(zhì)（raw materials)或?qū)⑵渑c添加劑（additive s)進(jìn)行混合的混料。這種 飼料根據(jù)目標(biāo)動(dòng)物（target animal)的特定的具體要求（specific requirements)而進(jìn)行 劑型化。商業(yè)制作的混合飼料中使用的主成分通常包括：如麩皮（wheat bran)、米糠 （rice bran)、玉米粉（corn meal)、大麥（barley)、小麥（wheat)、黑麥（rye)及燕麥（oat)等的 谷物（cereal grains);豆柏（soybean meal);苜猜草粉（alfalfa meal);小麥粉（wheat powder)等。商業(yè)復(fù)合飼料（commercial compound feed),雖然本發(fā)明未在這樣的側(cè)面進(jìn)行 特別的限定，但是通常會(huì)包括易于消化的整體營養(yǎng)素 （digestible total nutrients)。不 僅是半固體（semi-solid),液體、固體的動(dòng)物飼料混料也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種混 料通常制作為搗碎的谷物類（meal type)、顆粒（pellets)或細(xì)屑（crumbles)。實(shí)際上，通 常會(huì)喂家畜如本發(fā)明的這種混合飼料的組合及青貯（silage)或干草等。通常，混合動(dòng)物飼 料是以0. 3至10kg/動(dòng)物/天的范圍內(nèi)的量進(jìn)行供給。本【技術(shù)領(lǐng)域】的熟練者可以考慮動(dòng)物 的類型及儲(chǔ)存其的環(huán)境來決定包括混合動(dòng)物飼料的這種成分的適當(dāng)?shù)牧俊?br> [0039] "飼料添加劑（feed supplement)"被認(rèn)為是，為了符合本發(fā)明地補(bǔ)充預(yù)混料或 添加劑來形成飼料而在動(dòng)物的食料或配給（ration)中添加的，包括有效成分（active ingredients)的濃縮添加劑預(yù)混料（concentrated addit ive premix)。用語"動(dòng)物飼 料預(yù)混料（animal feed premix)"、"動(dòng)物飼料添加劑"及"動(dòng)物飼料添加物（animal feed additive)"通常被認(rèn)為是具有類似或相同的意思，通?？梢越惶媸褂?。通常，本發(fā)明的動(dòng) 物飼料添加劑為粉末（powder)或壓縮性（compacted)或顆粒型固體（granulated soli d)的形態(tài)。特別是，在家畜的配給（ration)中直接添加其，例如，通常在所謂配給上噴灑 (top-dress)肥料來直接喂食動(dòng)物飼料添加劑或?qū)⑵涫褂糜谌缁旌蟿?dòng)物飼料（compounded animal feeds)或藤磚（lick blocks)的產(chǎn)物的制作（manufacture)或制備（preparation) 中。
[0040] "腸道的甲燒生成減少（reducing gastro-intestinal methanogenesis)" 是表 示在胃腸道（gastro-intestinal tract)中的甲燒氣體生成的減少。反芻動(dòng)物的反芻胃 及內(nèi)臟（gut)中的發(fā)酵，會(huì)由所謂的產(chǎn)甲烷菌而生成甲烷氣體。本發(fā)明的目的在于減少甲 燒排放(methane excretion)。評價(jià)動(dòng)物排放的甲燒是本發(fā)明【技術(shù)領(lǐng)域】的熟練者所具備的 技術(shù)（skill)及知識(shí)范圍。反芻胃及內(nèi)臟中的甲烷生成是健康的動(dòng)物通常會(huì)發(fā)生的過程 (process),減少甲燒生成反應(yīng)不會(huì)提升或弱化反芻動(dòng)物的健康或幸福（wellbeing)的通常 狀態(tài)。甲烷生成的減少會(huì)增加使用營養(yǎng)素的動(dòng)物的效率性，因此可以增進(jìn)動(dòng)物的生長及/ 或生產(chǎn)率（productivity)。
[0041] "基質(zhì)"是由酶作用而轉(zhuǎn)換為另一化合物或轉(zhuǎn)換的任意物質(zhì)或化合物的統(tǒng)稱。所述 用語并不僅是單指化合物，還包括：含有溶劑、混合物及最少一個(gè)基質(zhì)的如其他材料的化合 物的組合及其衍生物。此外，用語"基質(zhì)"作為生物質(zhì)能（biomass)衍生的如食糖的起始原 料，不僅僅是提供適合使用的碳素供給源，是包括本說明書中記載的代謝調(diào)控微生物相關(guān) 的路徑中使用的中間產(chǎn)物和最終代謝產(chǎn)物。包括由微生物通常使用的適合的碳素基質(zhì)。 [0042] "機(jī)能"及"機(jī)能性"等是指生物學(xué)或酶功能。
[0043] "增加的"或"增加"是指，如非轉(zhuǎn)化型微生物或相異轉(zhuǎn)化的微生物的相比于對照微 生物，可以生產(chǎn)更多的給定的產(chǎn)物或分子(例如，通用的化學(xué)物質(zhì)、生物燃料或其中間產(chǎn)品） 的一個(gè)以上的重組微生物的能力。
[0044] "從?獲得"或"?由來的"是指，例如，從規(guī)定有機(jī)體、從如典型的微生物的特定供 給源斷離或從其衍生的如多核苷酸提取物或多肽提取物等的樣本。此外，也可以指，從特定 有機(jī)體或微生物斷離多核苷酸或多肽序列或從其衍生的狀況。
[0045] "外來"通常是指，不為野生型細(xì)胞或有機(jī)體中自然而生，而是通過典型的分子生 物學(xué)技術(shù)，即，通過用于重組微生物的工學(xué)處理來導(dǎo)入到細(xì)胞中的多核苷酸序列或多肽。
[0046] "重組"微生物典型的有，例如，質(zhì)粒或載體（vector)中包括一個(gè)以上的外來核苷 酸序列。
[0047] "約"是指對于參照量、水準(zhǔn)、值、數(shù)、頻度、百分比、尺數(shù)、大小、量、重量或長度具有 30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%程度的變化的量水準(zhǔn)、值、數(shù)、頻度、百分比、尺數(shù)、 大小、量、重量或長度。
[0048] 通過本說明書，在語境中未提出其他需求時(shí)，"包括"及"包括的"應(yīng)當(dāng)理解為，在包 括所提示的步驟或元素或者步驟或元素的群以外，不排除還包括有任意的其他步驟或元素 或者步驟或元素的群。
[0049] 本發(fā)明中使用的所有技術(shù)用語在未進(jìn)行其他定義的情況下，以本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常理解的意思來使用。此外，本說明書中記載了優(yōu)選的方法或樣本，但 是與此類似或等同的范圍也包括于本發(fā)明的范疇內(nèi)。本說明書中作為參考文獻(xiàn)記載的所用 刊行物的內(nèi)容都會(huì)導(dǎo)入到本發(fā)明中。
[0050] 下面，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說明。
[0051] 本發(fā)明人們在收集奶牛及傳統(tǒng)山羊的反芻胃液進(jìn)行培養(yǎng)后，通過分離及確認(rèn)還 原性產(chǎn)乙酸菌的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新的菌株。
[0052] 本發(fā)明是涉及這種新的還原性產(chǎn)乙酸菌株及其用途，是涉及具有抑制反芻動(dòng)物的 反芻胃內(nèi)的甲燒生成機(jī)能的Proteiniphilum屬微生物及其多種利用。
[0053] 本發(fā)明中使用的"反芻動(dòng)物"為屬于哺乳目的動(dòng)物，是在消化形態(tài)上具有將吞咽過 一次的食物重新凸出并咀嚼的特性的動(dòng)物，亦稱之為反芻亞目動(dòng)物。本發(fā)明的反芻動(dòng)物屬 于駱駝科、小鹿科、鹿科、長頸鹿科、牛科的動(dòng)物中。本發(fā)明的反芻動(dòng)物只要是屬于駱駝科、 小鹿科、鹿科、長頸鹿科、?？频呐?、山羊、黃牛、水牛、野牛、鹿、駱駝、羊等的具有反芻胃的 動(dòng)物，就不會(huì)對其進(jìn)行限定，但優(yōu)選為牛。
[0054] 反芻胃中棲息有多個(gè)細(xì)菌、原生動(dòng)物及真菌等的厭氧性微生物，它們起到通過發(fā) 酵過程消化反芻動(dòng)物攝取的飼料的作用。
[0055] 反芻動(dòng)物在攝取包括碳水化合物的飼料時(shí)，因反芻胃內(nèi)的微生物發(fā)酵及分解而作 為最終分解產(chǎn)物會(huì)生成揮發(fā)性脂肪酸、氫、二氧化碳、氨等，其中，因?yàn)閾]發(fā)性脂肪酸或氨會(huì) 被反芻動(dòng)物或反芻胃內(nèi)的微生物所利用，因此不會(huì)出現(xiàn)大礙。但是，二氧化碳及氫會(huì)因反芻 動(dòng)物內(nèi)的產(chǎn)甲烷微生物而生成為甲烷，或因競爭性產(chǎn)乙酸菌而生成乙酸，特別是在生成甲 烷時(shí)，存在著不會(huì)被反芻動(dòng)物的體內(nèi)所吸收而是以每小時(shí)15至20回的程度來排放至大氣 中的問題。
[0056] 反芻動(dòng)物的反芻胃中生成的甲烷只會(huì)在沒有氧氣的厭氧狀態(tài)下發(fā)生，會(huì)占甲烷發(fā) 生的總原因中的約15%，是引發(fā)地球溫室化的主要物質(zhì)。此外，反芻動(dòng)物從飼料中攝取的總 能量的3至12%會(huì)因生成甲烷而引起能量流失，因此還與飼料利用效率密切相關(guān)。
[0057] 如上所述，反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)生成甲烷時(shí)，會(huì)引發(fā)由地球溫室化導(dǎo)致的環(huán)境問 題，并且會(huì)導(dǎo)致飼料利用效率的降低，因此當(dāng)前的現(xiàn)狀為，為了抑制其生成而進(jìn)行著多種方 案的研究。
[0058] 本發(fā)明在一觀點(diǎn)上是涉及具有抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成機(jī)能的作為 Proteiniphilum屬微生物(菌株）的還原性產(chǎn)乙酸菌。
[0059] "還原性產(chǎn)乙酸菌"是指，當(dāng)反芻動(dòng)物攝取包括碳水化合物的飼料時(shí)，在由反芻動(dòng) 物胃內(nèi)的微生物發(fā)酵及分解后的最終產(chǎn)物中，利用氫或二氧化碳來生成乙酸的菌。
[0060] 反芻動(dòng)物在攝取包括碳水化合物的飼料時(shí)，會(huì)因甲烷生成微生物而在反芻胃中生 成甲烷，這是引發(fā)地球溫室化的主要原因之一，且為降低飼料利用效率的原因之一，因此抑 制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成是很重要的。本發(fā)明的還原性產(chǎn)乙酸菌有效地與甲烷 生成微生物進(jìn)行基質(zhì)競爭來生成乙酸，因此可以很有效地抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)甲烷生 成。
[0061] 本發(fā)明的還原性產(chǎn)乙酸菌作為具有抑制反芻胃內(nèi)甲烷生成機(jī)能的Prot einiphilum 屬微生物，最優(yōu)選為 Proteiniphilum acetatigenes 菌株。
[0062] 本發(fā)明的一實(shí)施例中，將從傳統(tǒng)山羊的反芻胃中分離的新的Proteinip hilum acetatigenes 菌株命名為了 Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1。
[0063] 具體為，本發(fā)明人們在收集奶牛及傳統(tǒng)山羊的反芻胃液進(jìn)行培養(yǎng)后，分離還原性 產(chǎn)乙酸菌并進(jìn)行確認(rèn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了新的菌株，其中將具有優(yōu)秀的甲烷去除機(jī)能的菌株GA3 命名為了 Proteiniphilum acetatigenes SR0 D-1，并且在2011年11月9日，在韓國微生 物保藏中心以委托編號(hào)KCC M11219P進(jìn)行了保藏。
[0064] 一具體實(shí)施例中，在AC-B1培養(yǎng)基中分別接種了不同的菌株進(jìn)行培養(yǎng)之后，利 用還原性產(chǎn)乙酸遺傳基因來特異性地檢測還原性產(chǎn)乙酸菌的結(jié)果顯示，篩選出了總4種 的作為菌株的DA02、GA01、GA02及GA03。此外，觀察所述篩選的菌株的發(fā)酵特性的結(jié)果 顯示，篩選的所有菌株中都檢測出了大量的乙酸，特別是在作為GA03的Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1 (KCCM11219P)中檢測出了最大量的乙酸。
[0065] 另一具體實(shí)施例中，利用所述篩選的4種菌株在in vitro發(fā)酵系統(tǒng)中查看揮發(fā)性 脂肪酸含量的結(jié)果顯示，使用淀粉及酪蛋白為基質(zhì)的所有群都表現(xiàn)出了最大的含量，并且 不同于對照群，其中未檢測出乳酸酯（laclate)。
[0066] 又另一具體實(shí)施例中，利用所述篩選的4中菌株來查看抑制甲烷生成機(jī)能的結(jié)果 顯示，使用淀粉為基質(zhì)的情況下表現(xiàn)出了最優(yōu)秀的抑制甲烷生成機(jī)能，特別是作為GA03的 Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1的抑制甲燒生成的程度優(yōu)秀。
[0067] 因此，本發(fā)明的Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1相比于已報(bào)告的任何其他 用于抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的微生物，可以有效地進(jìn)行使用，特別是，可以 有效地使用于抑制以碳水化合物作為根源來生成甲烷。
[0068] 本發(fā)明的另一觀點(diǎn)是涉及包括所述還原性產(chǎn)乙酸菌的抑制甲烷生成用微生物制 劑。
[0069] 所述還原性產(chǎn)乙酸菌為Proteiniphilum屬微生物，最優(yōu)選為Proteiniph ilum acetatigenes SR0D_l〇
[0070] 本發(fā)明中，所述微生物制劑可以使用單一種的由本發(fā)明人們新發(fā)現(xiàn)的所述 Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1，也可以使用混合2種以上微生物的形態(tài)?；旌? 種以上微生物的情況可以包括：選自除Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1以外公知的 具有甲烷生成機(jī)能的微生物所構(gòu)成的群中的一個(gè)以上，但并不限定于此。
[0071] 本發(fā)明中，所述微生物制劑可以為粉末或液狀的形態(tài)。
[0072] 所述粉末形態(tài)的微生物制劑時(shí)，根據(jù)所述微生物的特征，需要在厭氧狀態(tài)下進(jìn)行 培養(yǎng)，并且在附著于載體后，干燥至水分含量在〇. 1至10重量％后，粉碎并制品化。當(dāng)水分 含量超過10重量％時(shí)，會(huì)導(dǎo)致降低微生物的再活性化效率或使抑制甲烷生成的效果增量甚 微，因此在經(jīng)濟(jì)性角度上來說，不優(yōu)選采用。本發(fā)明的菌株作為厭氧微生物，在以粉末形態(tài) 與液狀形態(tài)來生產(chǎn)微生物制劑時(shí)，需要在厭氧狀態(tài)的條件下進(jìn)行制作生產(chǎn)。
[0073] 作為所述載體可以使用選自由粘土類、活性炭、焦炭、煉鋼廠廢渣、火山灰及灰構(gòu) 成的群中的一個(gè)以上，所述粘土類可以使用選自由沸石、蛭石、硅藻土、高嶺土、陶土、長石 及滑石構(gòu)成的群中的一個(gè)以上，但并不限定于此。
[0074] 所述粉末形態(tài)的微生物制劑中可以添加賦形劑。所述賦形劑可以單獨(dú)使用或混合 兩種以上的氨基酸、維生素 C、維生素 E、殼聚糖及葡萄糖，但并不一定限定于此。
[0075] 所述液狀形態(tài)的微生物制劑時(shí)，將所述微生物的培養(yǎng)液進(jìn)行混合或稀釋，并為了 穩(wěn)定微生物而混合葡萄糖或甘油后，制作為最終濃度為1至10重量％，優(yōu)選制作為1至5重 量％。當(dāng)微生物不足1重量％時(shí)，微生物制劑的甲烷去除效果會(huì)甚微，當(dāng)超過10重量％時(shí)， 抑制甲烷生成的效果增量甚微，因此在經(jīng)濟(jì)性角度上來說，不優(yōu)選采用。以液狀形態(tài)來使用 微生物制劑時(shí)，相比于粉末制品，具有活性快且攝取簡便的優(yōu)點(diǎn)。
[0076] 本發(fā)明的又另一觀點(diǎn)是涉及，以包括所述抑制甲烷生成用微生物制劑為特征的牲 畜用飼料或飼料添加劑。
[0077] 所述飼料雖然并不一定限定于此，但可以使用由玉米、小麥、豆柏、豆、大米等的任 意一個(gè)或由選自由它們構(gòu)成的群中的兩個(gè)以上的混合物進(jìn)行粉碎而獲得的粉碎物與由加 工它們的過程中所獲得的如米糠、小麥糠、大麥糠的加工副產(chǎn)物。
[0078] 所述牲畜用飼料，其特征在于，包括的所述抑制甲烷生成用微生物制劑對于飼料 總重量為0. 3至0. 5重量％，優(yōu)選為0. 4重量％。所述微生物制劑在包括不足0. 3重量％時(shí)， 牲畜用飼料的抑制甲烷生成的效能會(huì)甚微，超過〇. 5重量％時(shí)，效果幾乎與含量在其以下時(shí) 相同，因此對比與效果顯示出了非經(jīng)濟(jì)性。
[0079] 所述牲畜用飼料雖然并不一定限定于此，是用于提供給駱駝科、小鹿科、鹿科、長 頸鹿科、?？频鹊木哂蟹雌c胃的動(dòng)物，優(yōu)選為用于提供給牛。
[0080] 本發(fā)明的牲畜用飼料混料可以包括：本【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的任何附加性 的飼料添加劑（feed additive)。如從業(yè)者公知，"飼料添加劑"是以增加飼料的質(zhì) 量（quality)及基于動(dòng)物源性（animal origin)來增加食物的質(zhì)或者，例如提供飼料 原料（feed materials)的增強(qiáng)的消化性（digesti bility)的用于增加動(dòng)物執(zhí)行力 (animals'performance)作為目的的動(dòng)物營養(yǎng)處理過程（animal nutrition)中使用 的產(chǎn)物。非限定性地有，防腐劑（preservatives)、抗氧化劑（antioxidants)、乳化劑 (emulsifiers)、穩(wěn)定劑（s tabilising agents)、酸度調(diào)節(jié)劑（acidity regulators)及青 貝亡飼料添加劑（s ilage additives)的技術(shù)性添加劑（technological additives);與感官 作用相關(guān)的添加劑（sensory additives),特別是香料（flavours)及著色劑（color ants); 如維生素、氨基酸及微量元素 （trace elements)的（附加的）營養(yǎng)性添加劑；以及如消化率 增進(jìn)劑及腸內(nèi)有益菌穩(wěn)定劑（gut flora stabilizer s)的（附加的）牲畜添加劑。
[0081] 本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑，在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)可以包括任何附加性構(gòu)成 組分（ingredient)。其可以包括通常以制作產(chǎn)物形態(tài)（product fo rm)為目的所需的公 知的賦形劑（excipient),其還可以包括以改善飼料的質(zhì)量（quality)及/或改善消耗 添加劑的動(dòng)物的執(zhí)行（performance)為目的的添加劑。這種賦形劑的適當(dāng)?shù)睦?，可以?括：載體（carrier);填充劑（f iller)，如乳糖、鹿糖、甘露醇(mannitol)、淀粉結(jié)晶纖維 素 （starch cryst alline cellulose)、碳酸氫鈉（sodium hydrogen carbonate)、氯化鈉 (sodi um chloride)等；以及粘合劑（binder),如阿拉伯樹膠（gum Arabic)、黃蓍膠（gum tragacanth)、藻酸鈉 （sodium alginate)、淀粉、PVP及纖維素衍生物等。本領(lǐng)域的熟練者 所公知的飼料添加物的例可以包括：維生素、氨基酸及微量元素（trace elements)、消化率 改善劑（digestibility enhance rs)及腸內(nèi)有益菌穩(wěn)定劑（gut flora stabilizers)等。
[0082] 牲畜用飼料內(nèi)的本發(fā)明的微生物為無毒，并對于酸、酵母、膽汁具有耐性而在流向 腸的期間具有可以存活的特性。此外，在厭氧環(huán)境下也顯示出了生理活性，并可以附生于腸 內(nèi)上皮細(xì)胞或粘膜。
[0083] 此外，攝取所述牲畜用飼料時(shí)，可以抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成來防止 地球溫室化，并可以增加飼料利用效率。
[0084] 另一方面，本發(fā)明作為所述還原性產(chǎn)乙酸菌的另一用途，包括將其給予給動(dòng)物來 抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法。
[0085] 本發(fā)明中，所述還原性產(chǎn)乙酸菌是指，在反芻動(dòng)物攝取包括碳水化合物的飼料 時(shí)，利用由反芻胃內(nèi)的微生物進(jìn)行發(fā)酵及分解后的產(chǎn)物中的氫或二氧化碳來生成乙酸的 菌。所述還原性產(chǎn)乙酸菌只要是可以抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的微生物即可， 并不對其種類進(jìn)行限定，優(yōu)選為P roteiniphilum屬微生物，最優(yōu)選為Proteiniphilum acetatigenes SR0D_l〇
[0086] 所述Proteiniphilum acetatigenes SR0D-1作為由本發(fā)明人們從傳統(tǒng)山羊的反 芻胃中分離的新的還原性產(chǎn)乙酸菌，因有效地與甲烷生成微生物進(jìn)行基質(zhì)競爭來生成乙 酸，因此可以有效地抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成。
[0087] 本發(fā)明的方法中，所述給予是指將包括所述還原性產(chǎn)乙酸菌的微生物制劑或者包 括所述微生物制劑的牲畜用飼料提供給所述反芻動(dòng)物，但其只要是向反芻動(dòng)物提供所述還 原性產(chǎn)乙酸菌的方法即可，該方法并不限定于此。
[0088] 所述微生物制劑制作為粉末或液狀形態(tài)，并不對其形態(tài)進(jìn)行限定，可以使用所述 還原性產(chǎn)乙酸菌的1種或2種以上的混合形態(tài)。所述微生物制劑的特性及含量為如上所 述。
[0089] 所述牲畜用飼料作為用于使反芻動(dòng)物生長而給予反芻動(dòng)物的食物，本發(fā)明的牲畜 用飼料包括含有所述還原性產(chǎn)乙酸菌的微生物制劑，其特性及含量為如上所述。
[0090] 將所述還原性產(chǎn)乙酸菌給予動(dòng)物來使反芻動(dòng)物攝取時(shí)，可以抑制反芻動(dòng)物的反芻 胃內(nèi)的甲烷生成，由此可以防止地球溫室化并且可以增加飼料的利用效率。
[0091] 如上所述，本發(fā)明涉及作為還原性產(chǎn)乙酸菌的Proteiniphilum屬微生物的抑制 甲燒生成機(jī)能，特別是，本
【發(fā)明者】分離鑒定的Proteiniphilum ac etatigenes SR0D-1菌株 相比于目前所報(bào)告的任何其他微生物相比，顯示出了優(yōu)秀的抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲 烷生成的效果，可以有用地利用于抑制甲烷生成。
[0092] (實(shí)施例）
[0093] 下面，通過實(shí)施例想對本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)地說明。這些實(shí)施例僅僅是為了更加 具體地說明本發(fā)明，本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本 發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。
[0094](實(shí)施例1 :奶牛及傳統(tǒng)山羊的飼養(yǎng)環(huán)境及胃液的收集與培養(yǎng)）
[0095] 1-1.奶牛及傳統(tǒng)山羊的飼養(yǎng)環(huán)境
[0096] 奶牛是在順川大學(xué)附屬農(nóng)場進(jìn)行飼養(yǎng)，傳統(tǒng)山羊是在全羅南道求禮郡進(jìn)行了放牧 飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)中使用了安裝反芻胃漏管的荷斯坦黑白花（holstei n Friesian)種奶牛及山 羊。實(shí)驗(yàn)期間，奶牛是以體重的2%的水準(zhǔn)每天進(jìn)行了 2回的以6 :4比例的稻草與濃厚飼料 的給予；傳統(tǒng)山羊是自由給予稻草并在每天給予了 800g的肥育用濃厚飼料。
[0097] 1-2.反芻胃液的收集及培養(yǎng)
[0098] 反芻胃液是收集于所述實(shí)施例1-1的奶牛及傳統(tǒng)山羊。
[0099] 所述奶牛及傳統(tǒng)山羊中采取反芻胃液，利用4疊的紗布（cheese cloth)去除飼料 粒子后，保管于保溫及厭氧狀態(tài)的容器中來運(yùn)送到了實(shí)驗(yàn)室。
[0100] 向50ml的各個(gè)采取的反當(dāng)胃液血清瓶（Serum bottle)中添加 BES (b romoethanesulfonic acid)來使其最終濃度至 50mM后，用 80%N2_20%C02(vol%)氣體進(jìn)行了 1小時(shí)的冒泡。將注入80%N 2-20%C02(vol%)氣體的培養(yǎng)液作為對照區(qū)、將注入80%H2-20%C0 2 (vol%)氣體的培養(yǎng)液作為實(shí)驗(yàn)區(qū)，并用丁基橡膠塞與鋁帽來進(jìn)行了密封。之后，將對照區(qū)與 實(shí)驗(yàn)區(qū)放入39°C的晃動(dòng)培養(yǎng)箱中，以120rpm速度進(jìn)行了一周的的培養(yǎng)。（實(shí)施例2 :菌株的 分離及DNA提取）
[0101] 2-1.菌株的分離
[0102] 所述實(shí)施中，為了在1-2中收集及培養(yǎng)的反芻胃液中分離出與產(chǎn)甲烷微生物 (methanogens)有效地進(jìn)行基質(zhì)競爭的還原性產(chǎn)乙酸菌（reductive acetogen)，在5ml的 使用為選擇性培養(yǎng)基的具有下述表1的成分的AC-B1培養(yǎng)基（Le Van等，1998)中接種5% 的培養(yǎng)的反芻胃液后，在39°C的晃動(dòng)培養(yǎng)箱中，以120rpm速度進(jìn)行了一周的的培養(yǎng)。
[0103] 之后，將一次培養(yǎng)液0. 5ml以相同條件下在新鮮的AC-B1培養(yǎng)基中進(jìn)行了傳代培 養(yǎng)，并實(shí)施至了三次傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)附加性地注入了 80%H2-20%C02 (vol%)氣體。
[0104] 為了還原性產(chǎn)乙酸菌的純化分離，使用AC-B1培養(yǎng)基，以十進(jìn)制稀釋法對所述培養(yǎng) 的一至三次培養(yǎng)液稀釋至10°?ΚΓ9之后，將102?ΚΓ9稀釋液涂抹至AC-B1兒培養(yǎng)基后，在 厭氧室（Visionbionex，N2 :90%，H2 :5%，C02 :5%)內(nèi)的39°C的培養(yǎng)箱中進(jìn)行了一周的培養(yǎng)。之 后，為了最終分離還原性產(chǎn)乙酸菌，進(jìn)行再涂抹及培養(yǎng)后將分離菌株進(jìn)行了冷凍保管。
[0105] [表 1]
[0106]

【權(quán)利要求】
1. 一種Proteiniphilum屬的還原性產(chǎn)乙酸菌，其特征在于， 具有抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的機(jī)能。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Proteiniphilum屬的還原性產(chǎn)乙酸菌，其特征在于， 所述還原性產(chǎn)乙酸菌為，Proteiniphilum acetatigenes SROD-1 (KCC M11219P)。
3. -種抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成用微生物制劑，其特征在于， 包括權(quán)利要求1所述的Proteiniphilum屬的還原性產(chǎn)乙酸菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物制劑，其特征在于， 所述 Proteiniphilum 屬的還原性產(chǎn)乙酸菌為，Proteiniphilum acetatigen es SROD-1 (KCCM11219P)。
5. -種牲畜用飼料，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的還原性產(chǎn)乙酸菌制劑或權(quán)利 要求4所述的微生物制劑。
6. -種抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法，其特征在于通過向動(dòng)物給予權(quán)利 要求1所述的還原性產(chǎn)乙酸菌制劑或權(quán)利要求4所述的微生物制劑而進(jìn)行抑制。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法，其特征在于， 所述還原性產(chǎn)乙酸菌為，Proteiniphilum acetatigenes SROD-1 (KCC M11219P)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的抑制反芻動(dòng)物的反芻胃內(nèi)的甲烷生成的方法，其特征在于， 所述給予是指，將包括所述還原性產(chǎn)乙酸菌的微生物制劑或包括所述微生物制劑的牲 畜用飼料提供給所述反芻動(dòng)物。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK104137944SQ201310161752
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月6日
【發(fā)明者】李相碩, 金善鎬, 具玟廷, 車副榮, 鄭昌大 申請人:斗山生物資源有限公司