專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物防治植物病害領域。具體而言，本發明涉及一株能夠高效防治植物病害的解淀粉芽孢桿菌及其用途，以及采用該解淀粉芽孢桿菌制備的生物防治制劑。
背景技術：
葡萄為落葉藤本植物，有“水果之神”的稱號，是世界上最古老的的植物之一。葡萄原產于歐洲、西亞和北非一帶。在我國主要產地為新疆、甘肅、山西、河北、山東等地。葡萄既可以作為水果直接食用，也可以用作釀造葡萄酒。葡萄食用具有抗病毒殺細菌、防癌抗癌、降低胃酸利膽、抗動脈粥樣硬化、補益和興奮大腦神經、利尿消腫安胎等功效；釀造的葡萄酒可補氣益血，滋陰生津，強筋健骨，通利小便。主治氣血虛弱，肺虛久咳，肝腎陰虛，心悸盜汗，腰腿酸痛，筋骨無力，風濕痹痛，面肢浮腫，小便不利等病癥。因此葡萄市場需求旺盛。但由于葡萄病害的危害，嚴重影響了葡萄產業的健康發展。葡萄白腐病(Conielladiplodiella)是葡萄產區危害較重的病害之一，每年由該病造成的產量損失達10% 30%，嚴重地塊達50%以上。該病病原菌主要侵染果實、幼莖和花序等，其中以果實危害最為嚴重，造成果實腐爛和落粒。病害一旦蔓延，對產量、品質、效益影響較大，造成許多果園減產甚至面臨毀園的危險。針對該病害的防治，主要以套袋或者化學防治，但往往會帶來人力成本過高、用藥盲目、超濃度用藥等問題。因此以生物藥物為主的生物防治技術是葡萄白腐病防治的必然趨勢。芽孢桿菌是一 種廣泛分布于各種不同生活環境中的腐生細菌，是一群好氧兼厭氧的產芽孢革蘭氏陽性桿菌的總稱，可以產生內生耐熱抗逆的芽孢。芽孢不僅對熱有抗逆性，還對紫外線、電磁輻射及一些化學藥品有很強的抗逆性，它可以忍受各種不良環境。由于具有如此強的抗逆性，使得它有利于生防菌劑的生產和劑型加工，也利于其在環境中的存活、定殖與繁殖。由于它們生長快、營養簡單、能夠形成具有較強抗逆性能力的芽孢，在產品開發中較非芽孢桿菌有效活菌數量高、性能穩定等優勢而備受矚目。芽孢桿菌是植物病害生防微生物的重要組成部分，可用于防治多種植物病害。芽孢桿菌作為生防菌防治植物病害的機制主要有:抗生作用、營養競爭、空間競爭、重寄生作用以及誘導植物產生抗性等機制，芽孢桿菌的生防機制主要是以產生拮抗物質抑制有害病菌的生長或殺死病原菌。這些物質絕大多數為肽類抗生素，具有高效、低殘留、與環境友好等優點。
發明內容
本發明的目的是提供一種用于高效防治多種植物病害的新的芽孢桿菌——解淀粉芽孢桿菌RCD-1。該菌株具有生長速度快、產孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。本發明所提供的菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) RCD-1,是從山東省濰坊市濰北地區沿海灘涂地的土壤中分離獲得的，已于2013年4月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC N0.7502。其具有以下生物學特性:在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基或LB培養基上菌落形態為圓形或不規則形，乳白偏黃色，表面粗糙起褶皺，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，28°C下培養兩天后，鏡檢，菌體細胞呈桿狀，能運動。經革蘭氏染色呈陽性(以大腸桿菌為對照)。經芽孢染色后觀察芽孢呈橢圓形或柱狀。本發明解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株RCD-1的培養方法或繁殖方法包括:(I)普通培養保存采用牛肉膏蛋白胨瓊脂(NA)培養基，配方為胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂15-20g,蒸餾水IOOOmL, pH調至7.0-7.2 ；(2)實驗室液體培養采用牛肉膏蛋白胨液體培養基，配方為胰蛋白胨10g，牛肉膏3g,氯化鈉5g，蒸餾水IOOOmL, pH調至7.0-7.2 ；(3)大量發酵培養配方:黃豆粉2.5%，玉米粉3.5%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余為水。本發明還提供一種用于防治植物土傳病害的生物防治制劑，所述生物防治制劑包括所述的解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1。并且，本發明還提供了一種用于防治植物土傳病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土傳病害的植物施用上述解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1或者上述生物防治制劑。 本發明也提供了上述解淀粉芽孢桿菌菌或者上述生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途。就上述生物防治制劑、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以選自包括葡萄白腐病、黃瓜炭疽病、核桃炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病、板栗枝枯病、石槽干腐病等一種或幾種。在本發明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟:(I)將解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28-30°C搖床振蕩培養2-3d得到種子液；(2)按3.0%比例(體積比)將種子液接種到大量發酵培養基中，培養溫度28_30°C，培養時間30h，通風比1:0.9。發酵完成后得到發酵液，發酵液菌數可達100億/g。(3)將解淀粉芽孢桿菌發酵液與基質(選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種)進行混合均勻，干燥，經干燥后菌數可達500億/g。所述發酵液與發酵液基質的質量比為1:1。實驗表明，本發明的解淀粉芽孢桿菌菌株具有生長速度快、產芽孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。由該解淀粉芽孢桿菌制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產量，是一種極具應用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為生物農藥或生物肥料，防治多種土傳植物病害，包括葡萄白腐病、黃瓜炭疽病、核桃炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等一種或幾種。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例11、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株RCD-1的分離與純化本發明的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens) RCD-1是從土壤中采用稀釋平板法和平板劃線法分離獲得的，分離方法為:(I)芽孢桿菌的分離:土樣的采集，在山東省濰坊市濰北地區沿海灘涂地，采用5點取樣法，分別采集地塊四周和中央深度在10-20cm范圍內的土壤適量，等量混勻。標明采集地點、時間和采集人。稱取Ig 土樣于IOOmL無菌水中，置于30°C搖床中150rpm震蕩lOmin，然后置于60°C水浴鍋中孵育30min，取100 μ LlO'10'1(Γ4稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨培養基平板上，每個梯度涂布三個平行，在30°C培養2d后挑取牛肉膏蛋白胨培養基上的不同形態的微生物菌落于牛肉膏蛋白胨培養基平板上進行劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化芽孢桿菌菌株，分別編號保存。⑵葡萄白腐病高效拮抗芽孢桿菌的篩選①初篩:采用對峙培養法，制備PDA平板，用打孔器在葡萄白腐病菌菌絲邊緣打取直徑為5mm的菌餅，移植在平板中央，四周2cm處接種芽孢桿菌株，置27°C生化培養箱培養。逐日觀察芽孢桿菌對病原菌的抑制作用。②復篩:將篩選到的具有高效拮抗活性的芽孢桿菌菌株進行復篩，主要是經過耐溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的芽孢桿菌菌株，進行盆栽防治試驗和田間試驗。本發明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治多種植物病害的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)菌株RCD-1。實驗證明，該解淀粉芽孢桿菌在防治葡萄白腐病顯示出非常高效的防治效果，使得農作物顯著增產。因而，本發明的解淀粉芽孢桿菌是具有廣泛應用前景的解淀粉芽孢桿菌新菌株，可以用于制備防治多種植物病害的生物防治制劑。2、菌株鑒定(I)微生物學特性:在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基或LB培養基上菌落形態為圓形或不規則形，乳白偏黃色，表面粗糙起褶皺，在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，28°C下培養兩天后，鏡檢，菌體細胞呈桿狀，能運動。經革蘭氏染色呈陽性(以大腸桿菌為對照)。經芽孢染色后觀察芽孢呈橢圓形或柱狀。(2)分子生物學特性該菌株的16s rDNA 基因序列測定結果如下(SEQ-1):CGCCTGCCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGAGCCAGCCGCCGAAGGTG實施例21、解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1發酵過程牛肉膏蛋白胨液體培養基，配方為:胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水IOOOmL, pH 調至 7.0-7.2。大量液體發酵培養基配方(質量百分含量):黃豆粉2.5%，玉米粉3.5%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余為水。解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1大量固體發酵過程:(I)將解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28_30°C搖床振蕩培養2-3d得到種子液；(2)按3.0%比例(體積比)將種子液接種到大量發酵培養基中，培養溫度28_30°C，培養時間30h，通風比1:0.9。發酵完成后得到發酵液，發酵液菌數可達100億/g。(3)將解淀粉芽孢桿菌發酵液與基質(選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種)進行混合均勻，干燥，經干燥后發酵液菌數可達500億/g。所述發酵液與發酵液基質的質量比為1:1。實施例3解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1對葡萄白腐病菌室內效果驗證1.實驗方法采用平板對峙培養法，將供試的葡萄白腐病菌菌餅(9mm)移至平板中央，四周2cm處接種解淀粉芽孢桿菌RCD-1菌株，置27°C生化培養箱培養，每個處理重復3次。待對照菌絲長滿平板時，采用十字交叉法測量菌落直徑、抑菌帶直徑，計算平均值和相對抑制率。2.結果由表I可以看出，解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1對葡萄白腐病菌菌絲生長均具有較強的抑制作用，抑菌帶直徑為15.16mm，菌絲生長抑制率為83.17%。表1.解淀粉芽孢桿 菌菌株RCD-1對葡萄白腐病菌室內抑菌活性測定
權利要求
1.解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) RCD-1,所述菌株的保藏編號為CGMCC N0.7502。
2.權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株RCD-1在防治植物土傳病害中的用途。
3.如權利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土傳病害為葡萄白腐病、黃瓜炭疽病、核桃炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一種或幾種。
4.一種生物防治制劑，包括權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株 RCD-1。
5.一種制備權利要求4所述的生物防治制劑的方法，其特征是，包括以下步驟: (1)將解淀粉芽孢桿菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液體培養基中，28-30°C搖床振蕩培養2-3d得到種子液；所述牛肉膏蛋白胨液體培養基為:胰蛋白胨10g，牛肉膏3g,氯化鈉5g，蒸餾水IOOOmL, pH調至7.0-7.2 ； (2)按體積比3.0%的比例將步驟(I)的種子液接種到大量發酵培養基中，培養溫度28-30°C，培養時間30h，通風比1:0.9 ;發酵完成后得到發酵液；所述大量發酵培養基為:黃豆粉2.5%,玉米粉3.5%, NaCl 0.1%，CaCO3 0.2%,其余為水； (3)將步驟(2)的發酵液與基質進行混合均勻，干燥；所述發酵液與基質的質量比為I: I ;所述基質選自草炭、微粉碳酸鈣和膨潤土中的一種或多種。
6.權利要求4所述的生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途。
7.如權利要求6所述的用途，其特征是，所述植物土傳病害為葡萄白腐病、黃瓜炭疽病、核桃炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一種或幾種。
8.一種植物土傳病害的生物防治方法，其特征是，向具有土傳病害的植物施用權利要求I的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株RCD-1或者權利要求4的生物防治制劑。
全文摘要
本發明公開了一株解淀粉芽孢桿菌及其應用，屬于生物防治植物病害領域。該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)RCD-1，保藏編號為CGMCC No.7502。本發明還公開了含有上述菌株的生物防治制劑及其制備方法。本發明的解淀粉芽孢桿菌菌株具有生長速度快、產芽孢量大、作用譜廣、抗逆性強，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應用前景。由該解淀粉芽孢桿菌制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產量，是一種極具應用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為生物農藥或生物肥料，防治多種土傳植物病害，尤其是葡萄白腐病。
文檔編號A01P3/00GK103215209SQ20131014553
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月24日 優先權日2013年4月24日
發明者李鵬, 牛贍光, 王清海, 李泉涌, 劉幸紅, 李紅梅 申請人:牛贍光, 李鵬