CrylAc基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了Cry1Ac基因及其在培育抗棉紅鈴蟲和/或棉鈴蟲棉花品種中的應用。該基因的轉(zhuǎn)基因品系對于靶標害蟲的矯正死亡率極顯著高于轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花品種GK19。
【專利說明】CryIAc基因及其應用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體是涉及CrylAc基因及其在制備抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國，自1997年種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花以來，現(xiàn)全國年種植面積已達550萬hm2,在全世界居第二位,僅次于印度[1]。根據(jù)中棉所、全國優(yōu)質(zhì)棉科技服務項目組2007年對全國16個產(chǎn)棉省(市區(qū))的調(diào)查結(jié)果，全國棉花播種品種471個，其中轉(zhuǎn)基因抗蟲棉157個，占全部品種的33.3%，其播種面積占總播種面積的66.1% [2]。但值得注意的是，在這些轉(zhuǎn)基因棉花品種中，除少數(shù)品種外為轉(zhuǎn)CrylA+CpTI雙價抗蟲棉外，絕大多數(shù)品種都為轉(zhuǎn)單價Bt基因棉。而且在157個轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種中，除了其中4個為美國引進品種，其他幾乎所有品種的基因來源高度集中，幾乎都是CryIA基因。按照目前公認的Bt毒蛋白基因分類方法，根據(jù)其毒蛋白的氨基酸序列的同源性、抗原性及殺蟲范圍，可以將其Bt基因分Cryl、CryII, CryIII, CryIV, CryV及CryVI幾個大類，其中其CryI又可以分為 CryIA(a) >CryIA(b) >CryIA(c) >CryIB>CryIC 等 10 幾中，但 CryI 和 CryIII 應用最廣[3’4]。按照科學規(guī)律，單價抗蟲棉在大田生產(chǎn)上一般只能安全應用8~10年[5’6]，而轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在中國種植時間已達10多年，棉鈴蟲對Bt基因耐受性逐年增加，現(xiàn)在抗性風險已越來越大。因此，當前我國棉花生產(chǎn)急需轉(zhuǎn)新型抗蟲基因、轉(zhuǎn)多價基因及轉(zhuǎn)基因抗蟲與常規(guī)形態(tài)抗蟲相結(jié)合的抗蟲棉花新品種。本項目構(gòu)建的雙價基因CryVA(a)和CryVA(b)基因均屬于CryV型Bt基因，為棉花生產(chǎn)應用的新型抗蟲基因，該類型基因具有兼抗鱗翅目抗蟲和鞘翅目抗蟲的特性M，這將擴大抗蟲棉的抗蟲譜，減少棉鈴蟲的抗性風險的產(chǎn)生。
[0003]通過構(gòu)建新型雙價抗蟲基因，利用已有的優(yōu)良種質(zhì)資源，結(jié)合常規(guī)育種方法，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗的新型轉(zhuǎn)基因棉花新品種(系)，實現(xiàn)擴展抗蟲譜，增強抗蟲性，改變抗蟲基因單一性目標，對減輕棉鈴蟲危害、延緩或防止抗性棉鈴蟲的產(chǎn)生，減少環(huán)境污染，提高棉花產(chǎn)量和品質(zhì)，增加棉農(nóng)收入等方面具有十分重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明一方面涉及一種CrylAc基因，其具有與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或者其互補序列至少99%同源性的核苷酸序列，優(yōu)選為具有100%同源性。
[0005]本發(fā)明另一方面還涉及上述CrylAc基因在培育抗棉紅鈴蟲和/或棉鈴蟲棉花品種中的應用。
【具體實施方式】:
[0006]CrylAc 基因序列:
[0007]根據(jù)棉花對遺傳密碼子的偏好，同時根據(jù)CrylAc的氨基酸序列，設計出SEQ IDN0.1所示的CrylAc基因，在NCBI進行Blast比對，未發(fā)現(xiàn)高度同源序列。[0008]ATGGACAACAACCCAAACATCAACGAATGCATTCCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTGAAGTACTTGGTGGAGAACGCATTGAAACCGGTTACACTCCCATCGACATCTCCTTGTCCTTGACACAGTTTCTGCTCAGCGAGTTCGTGCCAGGTGCTGGGTTCGTTCTCGGACTAGTTGACATCATCTGGGGTATCTTTGGTCCATCTCAATGGGATGCATTCCTGGTGCAAATTGAGCAGTTGATCAACCAGAGGATCGAAGAGTTCGCCAGGAACCAGGCCATCTCTAGGTTGGAAGGATTGAGCAATCTCTACCAAATCTATGCAGAGAGCTTCAGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCGCGAGGAAATGCGTATTCAATTCAACGACATGAACAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACTAGGCTGATTGGAAACTACACCGACCACGCTGTTCGTTGGTACAACACTGGCTTGGAGCGTGTCTGGGGTCCTGATTCTAGAGATTGGATTAGATACAACCAGTTCAGGAGAGAATTGACCCTCACAGTTTTGGACATTGTGTCTCTCTTCCCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCCGTACAGTGTCCCAACTTACCAGAGAAATCTATACTAACCCAGTTCTTGAGAACTTCGACGGTAGCTTCCGTGGTTCTGCCCAAGGTATCGAAGGCTCCATCAGGAGCCCACACTTGATGGACATCTTGAACAGCATAACTATCTACACCGATGCTCACAGAGGAGAGTATTACTGGTCTGGACACCAGATCATGGCCTCTCCAGTTGGATTCAGCGGGCCCGAGTTTACCTTTCCTCTCTATGGAACTATGGGAAACGCCGCTCCACAACAACGTATCGTTGCTCAACTAGGTCAGGGTGTCTACAGAACCTTGTCTTCCACCTTGTACAGAAGACCCTTCAATATCGGTATCAACAACCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTTCGCCTATGGAACCTCTTCTAACTTGCCATCCGCTGTTTACAGAAAGAGCGGAACCGTTGATTCCTTGGACGAAATCCCACCACAGAACAACAATGTGCCACCCAGGCAAGGATTCTCCCACAGGTTGAGCCACGTGTCCATGTTCCGTTCCGGATTCAGCAACAGTTCCGTGAGCATCATCAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAGTTCAACAACATCATCGCATCCGATAGTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAAACTTTCTCTTCAACGGTTCTGTCATTTCAGGACCAGGATTCACTGGTGGAGACCTCGTTAGACTCAACAGCAGTGGAAATAACATTCAGAATAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCCCATCCACATCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTCACCTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATCTTCTCCAATACAGTTCCAGCTACAGCTACCTCCTTGGATAATCTCCAATCCAGCGATTTCGGTTACTTTGAAAGTGCCAATGCTTTTACATCTTCACTCGGTAACATCGTGGGTGTTAGAAACTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATTATCGACAGATTCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAGGCTGAGTACAATCTTTAA`[0009]使用takala公司的PRIIOl-AN作為表達載體，通過酶切(酶切位點為合成時在兩端加入，分別為Hindlll+SphI)組合把11(1111+3?111將07認(3基因序列整合到表達載體上。
[0010]Cry5b基因的PCR檢測
[0011]從轉(zhuǎn)CrylAa基因棉花品系中提取總DNA，利用特異引物進行PCR擴增，以未轉(zhuǎn)化材料為陰性對照，以攜帶有目的片段的質(zhì)粒為陽性對照。結(jié)果表明，各樣品都有特異性條帶，與質(zhì)粒的陽性對照條帶大小相同，約為700bp，而陰性對照沒有擴增條帶，擴增結(jié)果與預期的結(jié)果相一致。所檢測的轉(zhuǎn)CrylAa基因棉花植株的PCR結(jié)果呈陽性，可以初步證明Cry5基因已經(jīng)整合到棉花基因組中。
[0012]RT-PCR 檢測
[0013]RT-PCR結(jié)果表明，CrylAa在RNA水平上得到了表達。
[0014]ffestern-blot 分析
[0015]根據(jù)特異肽段序列CNPNQPCKDDLDRV合成CrylAa蛋白特異抗體，采用TCA-丙酮沉淀法提取轉(zhuǎn)CrylAa基因棉花品系JX0010，JX0020葉片蛋白質(zhì)，進行Western blot分析。結(jié)果從蛋白水平證實，CryIAa基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因品系JX0010，JX0020中能表達殺蟲毒蛋白。[0016]CrylAa基因的時空表達
[0017]利用合成的CrylAa基因表達毒蛋白特異抗體，采用ELISA方法，對轉(zhuǎn)基因品系JX0010和JX0020各個器官、不同時期的毒蛋白表達量進行了測定。從表中可以看出，JX0010的CryIAa毒蛋白表達較JX0020都要高，時間分布以蕾期表達最高，空間分布以葉片為最聞。
[0018]表1 CrylAa毒蛋白Elisa檢測
[0019]
【權(quán)利要求】
1.CryIAc基因，其具有與SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列或者其互補序列至少99%同源性的核苷酸序列，優(yōu)選為具有100%同源性。
2.權(quán)利要求1所述的 CrylAc基因在培育抗棉紅鈴蟲和/或棉鈴蟲棉花品種中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103525834SQ201310145046
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月25日
【發(fā)明者】王峰, 陳金湘, 周仲華, 劉海荷, 張秋平 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學