專利名稱：山綠茶種苗的快速繁育方法
技術領域：
本發明屬于植物組織培養技術領域，尤其是涉及一種山綠茶種苗的快速繁育方法。
背景技術：
山綠茶為冬青科植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的干燥葉經加工炮制而成。山綠茶療效明確、使用歷史悠久，已收載于《廣西中藥材標準》(1990年版)。山綠茶具有清熱解毒、消腫止痛、活血通脈的功效，主要用于降血壓、降血脂、降膽固醇及冠心病、腦血管意外所致的偏癱，以及風熱感冒、肺熱咳嗽、咽喉水腫、扁桃體炎、痢疾等病癥。藥理研究還表明山綠茶中的三萜類化合物具有抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗肝病毒抗炎和抗AIDS等活性。以山綠茶為主要原料制成的制劑作為降壓、降脂的常用中成藥，具有使用量較大、療效確切、毒副作用小、產品獨特等優點，在全國各地銷路很好，市場占有率高，有較好的經濟效益和持續發展前景。據《新華本草綱目》記載:“山綠茶，又名海南冬青，性寒，味苦，經入肝、脾、肺、腎，平息肝風，用于肝風頭痛及肝陽上亢頭痛、頭暈等癥”。申請人廣西萬壽堂藥業有限公司生產有決明山綠茶、山綠茶降壓膠囊等主導產品，在市場同類產品中銷量領先。山綠茶的原植物海南冬青是冬青科冬青屬植物，主要分布于廣西、廣東、海南和云南一帶，在廣西區內主要分布在大明 山附近各縣海撥超過600-800m的山上，目前企業收購的山綠茶藥材均來自于大明山附近的上林、武鳴、賓陽、馬山等地，均為野生的藥材資源，迄今尚未有栽培歷史。隨著山綠茶制劑新產品市場銷量的逐年增加，山綠茶藥材需求量也不斷增大，但經過多年采集，有限的野生資源已面臨枯竭，原料供不應求，致使藥材價格不斷上揚。為了滿足企業的生產需求，必須進行大面積的人工栽培，為藥材原料提供新的來源。目前，野生山綠茶主要通過種子繁殖，其種子胚組織發育不良，兼受季節、生長環境等因素的影響，種子繁殖率低，發芽率低于2% ;此外，繁育期長，繁殖后代變異大，成活率低，繁殖受自然條件限制等諸多問題，不能滿足大面積人工栽培的需要。經檢索，迄今為止，國內未見有關于山綠茶相關育種及栽培研究的報道，國外也無相關的研究記錄。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種成本低廉、操作簡便、增殖速度快、實用有效的山綠茶種苗的快速繁育方法，該法借助培養基和附加成份對山綠茶進行快速繁殖，增殖培養形成的種苗可直接用于大田種植，生產山綠茶藥材速度快、效果好、成活率高。為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:山綠茶種苗的快速繁育方法，包括以下步驟:( I)外植體選擇與滅菌取山綠茶成熟的漿果，消毒處理后剝開果皮取種子接種在種子萌發培養基中進行萌發培養，培養室溫度為24 28°C ；
(2)初代誘導待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉接到叢生芽誘導培養基中進行培養，培養20d ；(3)繼代增殖將初代誘導培養獲得的叢生芽切下單芽叢轉接到繼代培養基中進行增殖培養，培養 20d ；(4)生根當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基進行生根培養，培養周期25d;(5)煉苗移栽把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗3 5d，將瓶苗取出，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后即可上杯種植，30d后可進行大田栽培。種子萌發培養基為MS (Murashige and skoog (1962)培養基)+0.5
3.0mg.Ll-BA (6-芐基腺嘌呤)+0.1 1.0mg.T1NAA (萘乙酸)+ 蔗糖 25 30g.Γ1+瓊脂 5g.I71, pH6.0。叢生芽誘導培養基為MS+0.5 3.0mg.L_16-BA+0.8 1.8mg.L-1KT (激動素)+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L \ pH6.0。繼代培養基為M S+0.5 3.0mg Γ^-ΒΑ+Ο.1 1.0mg L^KT+0.1 1.0mg.L-1TDZ(喔苯隆)+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L S pH6.0。生根培養基為1/2MS+0.5 2.0mg.L-1IBA (吲哚丁酸)+0.1 1.0mg.L-1NAA+ 蔗糖 25 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。初代誘導、繼代增殖與生根的培養條件為溫度24 28°C，光照強度2000LX 3000Lx、光照時間 I Oh/d。步驟(I)中消毒處理是0.l%HgCl2溶液消毒處理5 IOmin。為緩解山綠茶原料來源緊張、供不應求的局面，發明人以山綠茶的種子為外植體，采用植物組織細胞繁殖法，建立了一種山綠茶種苗的快速繁育方法。該法包括外植體滅菌、初代誘導、繼代增殖、生根移栽等技術環節，使山綠茶迅速增殖，短時間內生產大量優質種苗，所得種苗可直接用于大田生產。本發明快速繁育方法生產成本低、操作簡便、增殖速度快、周期短(I 2個月)，可大量、快速、持續獲得高質量的山綠茶試管苗，而且全年皆可進行，便于大規模工業化生產應用。利用本發明繁殖山綠茶，移栽成活率高(84.1%以上)，種苗遺傳特性穩定，不會發生變異，有利于保持種苗的優良性狀，提高種苗使用的安全性，對藥用植物資源再生和持續利用具有十分積極的影響，可廣泛適用于商業化生產。
具體實施例方式實施例1( I)外植體選擇與滅菌取山綠茶成熟的漿果，用0.05%洗潔精溶液浸泡lOmin，再經流水沖洗15min，接著用0.1ffigCl2溶液消毒處理lOmin，然后用鑷子剝開果皮取種子接種在種子萌發培養基中進行萌發培養，培養室溫度為24 26°C，利用該法滅菌種子無污染；種子萌發培養基為MS+1.5mg -Γ^-ΒΑ+Ο.5mg -L^1NAA+ 蔗糖 25g -Γ1+ 瓊脂 5g. ΛρΗ6.00(2)初代誘導種子20d開始萌發(萌發率為83.2%)，待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉接到叢生芽誘導培養基中進行培養，培養IOd (溫度24 26°C，光照強度2000LX、光照時間10h/d)，叢生芽從無菌苗的下部葉腋處長出，繼續培養至20d轉接，誘導率為100% ;叢生芽發生過程不經過愈傷組織階段。叢生芽誘導培養基為MS+1.5mg.L 1B-BA+1.2mg.L ^T+0.5mg.L 1NAA+ 鹿糖25g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。(3)繼代增殖將初代誘導培養獲得的叢生芽切下單芽叢轉接到繼代培養基中進行增殖培養，培養20d(溫度24 26°C，光照強度2000Lx、光照時間10h/d)，叢生芽生長快，無玻璃化現象，增殖倍數為12.4 ;·
繼代培養基為MS+1.5mg.L_16-BA+0.5mg.L_1KT+0.5mg.L_1TDZ+0.5mg.L-1NAA+ 蔗糖 25g.I71+ 瓊脂 5g.I71, pH6.00(4)生根當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基進行生根培養，培養周期25d (溫度24 26°C，光照強度2000Lx、光照時間10h/d)，7d開始長根原基，25d后開蓋煉苗，生根率為91% ；生根培養基為1/2MS+1.2mg.Γ' ΒΑ+Ο.5mg.T1NAA+ 蔗糖 25g.Γ1+ 瓊脂 5g. ΛρΗ6.00(5)煉苗移栽把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗5d，用鑷子將瓶苗取出，用清水洗去粘附在根部的培養基，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后上杯種植，30d后進行大田栽培，移栽成活率86.2%。實施例2其它基本同實施例1，僅步驟(I)中用0.l%HgCl2溶液消毒處理5min，結果污染率為16.7%，萌發率83.4%，誘導率98.7%，增殖倍數12.7，生根率92%，移栽成活率85.8%。實施例3其它基本同實施例1，僅步驟(I)中種子萌發培養基為MS+0.5mg.L_16-BA+1.0mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0 ;培養室溫度為 26 280C，結果20d開始萌發，萌發率為84.6%，誘導率98.5%，增殖倍數12.5，生根率91%，移栽成活率86.1%。實施例4其它基本同實施例1，僅步驟(I)中種子萌發培養基為MS+3.0mg.L_16-BA+0.1mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.I71+ 瓊脂 5g.I71, ρΗ6.0 ;培養室溫度為 26 280C，結果20d開始萌發，萌發率為83.9%，誘導率99.3%，增殖倍數12.8，生根率90%，移栽成活率85.8%。
實施例5其它基本同實施例1，僅步驟(2)中叢生芽誘導培養基為MS+0.5mg Γ'θ-ΒΑ+Ι.8mg
L^KT+l.0mg.L-1NAA+蔗糖30g.L-1+瓊脂5g.L-1，pH6.0 ;培養30d后轉接，培養室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，誘導率為95.6%，萌發率83.7%，增殖倍數13.1，生根率91%，移栽成活率84.1%。實施例6其它基本同實施例1，僅步驟(2)中叢生芽誘導培養基為MS+3.0mg -Γ^-ΒΑ+Ο.8mg
Γ'ΚΤ+Ο.1mg.L- 1NAA+蔗糖30g.L-1+瓊脂5g.L-1，pH6.0 ;培養30d后轉接，培養室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，誘導率為96.3%，萌發率83.9%，增殖倍數12.9，生根率92%，移栽成活率85.9%。實施例7其它基本同實施例1，僅步驟(3)中繼代培養基為MS+0.5mg Γ'θ-ΒΑ+Ι.0mg.L^1KT+
1.0mg-L^TDZ+l.0mg.[1NAA+蔗糖 30g.L-1+瓊脂 5g. ΛρΗ6.0 ;培養室溫度為 26 28。。，光照強度3000Lx，培養20d后，增殖倍數為11.2，萌發率84.1%，誘導率99.2%，生根率90%，移栽成活率84.9%。實施例8其它基本同實施例1，僅步驟(3)中繼代培養基為MS+3.0mg Γ^-ΒΑ+Ο.1mg.L^1KT+
0.1mg -L^TDZ+0.1mg.[1NAA+蔗糖 30g.L-1+瓊脂 5g. ΛρΗ6.0 ;培養室溫度為 26 28。。，光照強度3000Lx，培養20d后，增殖倍數為11.7，萌發率84.2%，誘導率98.9%，生根率91%，移栽成活率85.7%。實施例9其它基本同實施例1，僅步驟(4)中生根培養基為1/2MS+0.5mg.L^1IBA+1.0mg.L-1NAA+ 鹿糖 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0 ;培養室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，培養25d后開蓋煉苗，生根率為90%，萌發率83.5%，誘導率99.4%，增殖倍數13.2，移栽成活率85.7%。實施例10其它基本同實施例1，僅步驟(4)中生根培養基為1/2MS+2.0mg.Γ' ΒΑ+Ο.1mg.T1NAA+ 蔗糖 30g.Γ1+ 瓊脂 5g. Λ ρΗ6.0 ;培養室溫度為26 28°C，光照強度3000Lx，培養25d后開蓋煉苗，生根率為91%，萌發率83.3%，誘導率99.2%，增殖倍數12.8，移栽成活率86.3%。實施例11其它基本同實施例1，僅步驟(5)中打開瓶蓋煉苗3d，移栽成活率84.1%，萌發率83.9%,誘導率98.6%,增殖倍數12.6，生根率90%。
權利要求
1.一種山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于包括以下步驟: (1)外植體選擇與滅菌 取山綠茶成熟的漿果，消毒處理后剝開果皮取種子接種在種子萌發培養基中進行萌發培養，培養室溫度為24 28°C ； (2)初代誘導 待子葉展開后，將無菌苗的根系切去，轉接到叢生芽誘導培養基中進行培養，培養20d ； (3)繼代增殖 將初代誘導培養獲得的叢生芽切下單芽叢轉接到繼代培養基中進行增殖培養，培養20d ； (4)生根 當繼代增殖芽苗長至2cm以上，從基部切成單個芽，轉接到生根培養基進行生根培養，培養周期25d ； (5)煉苗移栽 把生根的瓶苗搬到煉苗棚，打開瓶蓋煉苗3 5d，將瓶苗取出，清洗后移栽到細河沙上，移栽后IOd內保持相對濕度95%左右，溫度控制在20 26°C，無直射光，移栽15d后即可上杯種植，30d后可 進行大田栽培。
2.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述種子萌發培養基為 MS+0.5 3.0mg.L ^-BA+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L SρΗ6.00
3.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述叢生芽誘導培養基為 MS+0.5 3.0mg.L ^-ΒΑ+Ο.8 1.8mg.L ^T+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L-1+ 瓊脂 5g.L-1, pH6.0。
4.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述繼代培養基為 MS+0.5 3.0mg.L_16-BA+0.1 1.0mg.L_1KT+0.1 1.0mg.L_1TDZ+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L S pH6.0。
5.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述生根培養基為 1/2MS+0.5 2.0mg.L ^BA+0.1 1.0mg.L 1NAA+ 鹿糖 25 30g.L1+ 瓊脂 5g.L SpH6.0。
6.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于:所述初代誘導、繼代增殖與生根的培養條件為溫度24 28°C，光照強度2000Lx 3000Lx、光照時間10h/d。
7.根據權利要求1所述的山綠茶種苗的快速繁育方法，其特征在于步驟(I)中消毒處理是0.l%HgCl2溶液消毒處理5 lOmin。
全文摘要
本發明公開了一種山綠茶種苗的快速繁育方法，包括外植體滅菌、初代誘導、繼代增殖、生根移栽等技術環節，使山綠茶迅速增殖，短時間內生產大量優質種苗，所得種苗可直接用于大田生產，緩解山綠茶原料來源緊張、供不應求的局面。本發明快速繁育方法生產成本低、操作簡便、增殖速度快、周期短，可大量、快速、持續獲得高質量的山綠茶試管苗，而且全年皆可進行，便于大規模工業化生產應用。利用本發明繁殖山綠茶，移栽成活率高，種苗遺傳特性穩定，不會發生變異，有利于保持種苗的優良性狀，提高種苗使用的安全性，對藥用植物資源再生和持續利用具有十分積極的影響，可廣泛適用于商業化生產。
文檔編號A01H4/00GK103141395SQ201310114158
公開日2013年6月12日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者蒙永業, 譚文明, 利榮歡, 覃愛環 申請人:廣西萬壽堂藥業有限公司