一種硝酸鹽轉運體基因AtNRT1.1及其編碼蛋白與應用的制作方法
【專利摘要】本發明一種硝酸鹽轉運體基因AtNRT1.1及其編碼蛋白與應用,屬于植物分子生物學與轉基因相關【技術領域】。以擬南芥AtNRT1.1基因T-DNA插入突變體salk_138710的純合株系研究AtNRT1.1基因在植物耐低氮和氮素高效利用方面的功能。實驗結果表明，AtNRT1.1基因敲除突變體在不添加任何外源氮素的條件下，葉色比野生型綠，根長也稍長，呈耐低氮表型；在外加0.1mM和5mM硝酸銨處理條件下，突變體根系含氮量高于野生型而地上部含氮量卻顯著低于野生型(P=0.0001)。說明AtNRT1.1基因對不同濃度下的氮素吸收、轉運都具有重要的調控作用，預計該基因的沉默可提高植物的耐低氮能力并在植物氮素營養高效分子育種中具有較大的經濟價值。
【專利說明】—種硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1及其編碼蛋白與應用
所屬【技術領域】
[0001]本發明屬于植物分子生物學與轉基因相關【技術領域】。具體為擬南芥硝酸鹽轉運體(Nitrate transporters, NRTs)家族關鍵基因AtNRTl.1在低氮脅迫下的反應和作用機理，以及該基因在營養高效植物新品種培育中的應用。
【背景技術】
[0002]氮是植物必需的營養元素之一，是植物體內蛋白質、核酸、葉綠素、酶等的組成成分。氮素供應不足會影響植物的生長發育，限制農作物的產量；而氮肥施用過量則使氮素利用率下降，不僅造成資源浪費，而且引起環境污染。通過挖掘植物自身遺傳潛能，克隆耐低氮和氮素營養高效的基因，并利用轉基因技術培育氮素利用效率提高的新品種是解決這一問題的重要途徑之一。 [0003]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科、蕓薹屬植物，它不僅是第一個完成基因組序列測定的模式植物(Athanasios Theologis.et al., Nature, 2000,408:791-826)，而且具有植株小，生長周期短，種子數量多，基因組小且易于進行遺傳轉化，自花授粉而又易于雜交等優點。因此在植物分子生物學及轉基因相關【技術領域】中，擬南芥被作為模式植物廣泛加以研究和應用。
[0004]硝酸鹽轉運體是一類專司硝態氮吸收、運輸的轉運蛋白。研究發現擬南芥中存在一個由53個成員組成的NRT1基因家族。已有研究表明AtNRTl.1為雙親和性硝酸鹽轉運體基因(Guo Fang-qing et al.，Plant Cell，2001，13:1761-1777)，參與對營養生長和生殖生長時期初生器官發育的調控。但至今還沒有該基因在不同氮素濃度條件下對地上部分生長發育和氮素轉運的報道。
【發明內容】
[0005]本發明提供一個擬南芥雙親和性硝酸鹽轉運體基因，以及該基因對不同氮素濃度的反應和生理機制。
[0006]所提供的硝酸鹽轉運體基因為ATNRT1.1 (AT1G12110)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。
[0008]上述基因編碼的蛋白質具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
[0009]ATNRTl.1 基因的 T-DNA 插入突變體 salk_138710 是從 ABRC (ArabidopsisBiological Resource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。
[0010]通過上述鑒定，獲得ATNRTl.1基因T-DNA插入突變體salk_138710的純合株系，并以之為材料進行不同氮素濃度處理，觀察表型并拍照。然后對處理后的擬南芥幼苗進行根部及地上部含氮量的測量。
【專利附圖】
【附圖說明】[0011]圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結果，結果表明所獲ATNRTl.1基因T-DNA插入突變體株系salk_138710為純合插入株系，其轉錄本被敲除。
[0012]圖2顯示野生型和突變體在無外源氮培養基上處理7天后的表型圖片，結果表明突變體葉色比野生型綠且根長比野生型長，表現為耐低氮表型。
[0013]圖3顯示在0.1mM或5mM硝酸銨培養條件下處理3天后野生型和突變體根部和地上部含氮量差異，結果表明在0.1mM和5mM硝酸銨處理條件下，突變體根系含氮量高于野生型而地上部含氮量顯著低于野生型(P = 0.0001)。
【具體實施方式】
[0014]下面結合實驗方法和數據進一步闡述本發明。
[0015]1.擬南芥幼苗培養:
[0016]野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點布于含1%瓊脂的MS(Murashige and Skoog)固體培養基上，置于22°C光照培養箱中萌發生長。
[0017]2.純合突變體的鑒定:
[0018]DNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ 1 SDS 提取液(0.5% SDS (ff/V) ；200mM Tris-Hcl，PH = 8.0 ； 250mM NaCl ；25mM EDTA) ; 12，OOOr/min,離心3min ;取上清，加等體積異丙醇輕輕搖晃，靜置30min ；13, OOOr/min,離心5min ;棄上清,用lml95%乙醇沖洗1-2次后，自然風干,加去離子水30 μ 1，4°C保存備用。
[0019]RNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應物品事先用1% DEPC水浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約lg左右，于液氮中研磨成粉狀，加1ml TRIZOL提取液混勻，靜置lOmin ;4°C下12，OOOr/min離心lOmin ;取上清加300 μ 1氯仿混勻，靜置lOmin后4°C下12, 000r/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ 1水相轉移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 離心 lOmin,棄上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，OOOr/min 離心2min,晾干lmin左右，加60 μ 1無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，_70°C冰箱保存備用。
[0020]RT-PCR:所用反轉錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNA1 μ 1, oligo (dT) 18primerl μ 1, RNase-free waterl μ 1,65 °C處理 5min 后迅速冰浴冷卻；然后再加 5 X Reaction buffer4u 1, RibolockTM RNaseinhibitor(20u/μ 1)1 μ 1,lOmM dNTP Mix2μ 1, RevertAidTM H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ 1) 1 μ 1，42°C反應 60min ;70°C終止反應 5min，產物于 _20°C冰箱保存備用。
[0021]PCR檢測:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設計了 2對引物，1對用于T-DNA插入檢測(LP1:5 ' -TTTTGTGATATGGCTGTGCTG-3 '，RP1:5 ' -TCCGATACCTAAC GTCGTCAG-3 ')并結合T-DNA左邊界通用引物LBb 1.3:5 ' -ATTTTGCCGAT TTCGGAAC-3 '，通過PCR鑒定獲得純合插入突變體。另外 1 對用于 RT-PCR 檢測(LP2:5/ -ATCATACCGGGACTTCGACC-3' ；RP2:5 ' -CGGTCGGTCC ATTATTTGTC-3 ' )。PCR 反應體系如下:10Xbuffer2 μ 1，dNTP0.8 μ 1，Primer LP/RP 各 1μ 1，DNA1 μ 1，dH2014y 1，Taq 酶 0.2 μ 1。PCR 程序如下:94°C，3min ；(94°C,45sec ；58°C,45sec ；72°C,60sec) X30cycles ；72°C,5min0 產物采用 1% (ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓100V電泳20min，用BIO-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢測結果。
[0022]PCR和RT-PCR檢測的結果表明我們鑒定到AtNRT 1.1基因T-DNA插入突變體salk_138710的純合插入株系，其轉錄本被敲除。
[0023]3.不同濃度氮素處理:
[0024]在含1%瓊脂的固體MS培養基上生長5天的幼苗，轉移到含有0mM、0.1mM或5mM硝酸銨的培養基上，野生型和突變體各轉5-6株；22°C下光照培養7天后觀察表型并拍照。除不同氮素含量外，培養基中還包括ImM KH2P04, ImM MgS04,0.25mM CaCl2,0.1mMNa-Fe-ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA),ImM KC1,30mM H3B03,5mM MnS04, ImMZnS04, ImM CuS04，0.7mMNa2Mo04 和 3 % 蔗糖，培養基用 NaOH 調 PH 值至 5.7-5.75。幼苗在22°C光照培養7天后拍照，統計含氮量等指標。
[0025]結果表明，在無外源氮素培養條件下，突變體葉色比野生型綠且根長比野生型長，表現為耐低氮表型。這說明AtNRTl.1基因被敲出后解除了其對At-NRT2.1和AtNRT3.1的抑制，低氮脅迫加強了高親和性氮吸收的能力，增強了突變體的耐低氮能力。而含氮量測定結果表明，在0.1mM和5mM硝酸銨處理條件下，突變體根系含氮量高于野生型而地上部含氮量卻顯著低于野生型(P = 0.0001)，說明AtNRTl.1基因被敲出后，銨態氮的存在依然能夠抑制AtNRT2.1等氮轉運體的吸氮能力，使得突變體的總體氮素含量低于野生型。AtNRTl.1作為雙親和性轉運體不僅能夠調控氮素的吸收和轉運，也能夠調控植株的生長發育。
【權利要求】
1.擬南芥硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1，其堿基序列如SEQ ID N0.1。
2.權利要求1所述的硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQID N0.2。
3.權利要求1所述的硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1敲除突變體的低氮處理方法及條件。
4.權利要求1所述的硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1敲除突變體在低氮處理下所獲得的表型及其相關試驗數據。
5.權利要求1所述的硝酸鹽轉運體基因AtNRTl.1及其同源序列在制備耐低氮及氮素營養高效轉基因植物中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103642820SQ201310113427
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年4月3日 優先權日:2013年4月3日
【發明者】徐江, 徐小棟, 張少斌, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 洪雪, 麻艷超, 遲志海, 丁在松, 付金東, 趙明 申請人:中國農業科學院作物科學研究所