專利名稱：湘云金鳙純系群體的培育方法
技術領域：
本發明涉及一種魚類群體的培育方法，尤其涉及一種鳙魚純系群體的培育方法。
背景技術：
湖南湘云生物科技有限公司在普通鳙魚養殖過程中發現了體色突變為桔紅色的個體，經過長期選育，于2005年獲得了一個新的鳙魚養殖品系——湘云金鳙(參見圖1)(Aristichthys nobilis red.var)。因具備生長速度快、抗逆能力強、體型漂亮、味道鮮美、魚體色為桔紅色等優點，近年來，湘云金鳙深受漁業養殖戶以及消費者的歡迎，目前已經進行規摸繁殖和養殖，在四川、重慶、湖南等省市試驗養殖數萬畝，效果反應良好。由于湘云金鳙是一個基因突變品系，雖然經過了長期定向的選育，其很多性狀基因還處于雜合狀態，因近親交配的原因，在湘云金鳙的繁殖、養殖過程中發現有較嚴重的基因衰退現象，其表現個體紅顏色變淡、生長速度變慢、抗逆性降低、經濟性狀下降等現象(參見圖2)，這對湘云金鳙的生產和養殖造成不利影響，因此通過生物育種技術改良和穩定湘云金鳙的品質很有必要。不少學者利用人工誘導魚類雌核發育方法，成功獲得了雌核發育魚，這在篩選具有優良性狀的魚類個體方面積累了一定經驗。但到目前為止，關于人工誘導鳙魚進行雌核發育的報道很少，由于雌核發育操作過程容易損傷魚卵子，而且還存在精子滅活不適度、單倍體卵子二倍化處理不當等多種原因，這導致人工誘導雌核發育魚的孵化率和成活率不高，誘導方法成本高且過程復雜，至今沒有大規模建立雌核發育鳙魚群體的報道，更沒有相關文獻提出過采用人工誘導魚類雌核發育技術培育鳙魚純系群體的相關報道。
發明內容
本發明要解決的 技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能大大提高魚苗孵化率和存活率、且能培育出體色穩定、性狀優良的湘云金鳙純系群體的培育方法。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟:(I)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子激活湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°C 26°C條件下，激活后2min 4min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min，然后經流水控溫孵化，制備得到抑制第二極體排出的雌核發育湘云金鳙；(2)獲得雄性雌核發育魚:經步驟(I)后獲得的雌核發育湘云金鳙孵化數天后，投喂含雄性激素的飼料，滿足投喂周期的要求后，用不含雄性激素的普通飼料喂養至性成熟，獲得性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙；(3)自交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以步驟(2)中獲得的雄性雌核發育湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行自交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。
作為一個總的技術構思，本發明還提供一種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟:(I)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子刺激湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°c 26°C條件下，激活后21min 24min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min,然后經流水控溫孵化,制備得到抑制第一次卵裂的雌核發育湘云金鳙；(2)獲得雄性雌核發育魚:經步驟(I)后獲得的雌核發育湘云金鳙孵化數天后，投喂含雄性激素的飼料，滿足投喂周期的要求后，用不含雄性激素的普通飼料喂養至性成熟，獲得性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙；(3)自交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以步驟(2)中獲得的雄性雌核發育湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行自交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。相比上述的兩種技術方案，其區別主要在于在激活后的時間上作了調整，兩種雌核發育方式均能得到雌核發育湘云金鳙。上述的湘云金鳙純系群體的培育方法，所述步驟(2)中，雄性激素優選用17α-甲基睪丸酮，且每克飼料中優選含有40 μ g 60 μ g的17 α -甲基睪丸酮。上述的湘云金鳙純系群體的培育方法，所述步驟(2)中，雌核發育湘云金鳙孵化的天數優選為4 6天，飼料的投喂周期優選為80 100天，每天的投喂次數優選為2次。作為一個總的技術構思，本發明還提供第三種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟:(I)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子激活湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°C 26°C條件下，激活后2min 4min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min，然后經流水控溫孵化，制備得到抑制第二極體排出的雌核發育湘云金鳙；(2)雜交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以普通的雄性湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行雜交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。作為一個總的技術構思，本發明還提供第四種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟:(I)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子刺激湘云金鳙的成熟卵子，激活后21min 24min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min，然后經流水控溫孵化，制備得到抑制第一次卵裂的雌核發育湘云
金鳙；(2)雜交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以普通的雄性湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行雜交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。上述的四種培育方法中，其第(I)步都是基于人工誘導雌核發育技術培育出雌核發育湘云金鳙，其 中特別采用了異源四倍體鯽鯉(4n=200)的二倍體精子作為刺激源。異源四倍體鯽鯉的原始母本為紅鯽(Carassius auratus red var.),原始父本為鯉魚(Cyprinus carpio),選用的該異源四倍體鯽鯉兩性可育，且雌性和雄性分別能產生二倍體卵子和二倍體精子，兩者交配保證了該異源四倍體鯽鯉性能的代代相傳，目前已經繁殖到F21，形成了遺傳性狀穩定的四倍體魚新種群。該雄性異源四倍體鯽鯉產生的二倍體精子已經通過S0x-HMG DNA片段分析被證明為異源精子，其既含有紅鯽的DNA片段，又含有鯉魚的DNA片段。我們通過長期的有性雜交實驗，其實驗結果表明:以雌性湘云金鳙為母本，以雄性的異源四倍體鯽鯉為父本，其雜交組合不能獲得成活魚苗，雜交苗往往在發育過程中保持明顯區別于湘云金鳙胚胎的外形，如胚胎不同程度地呈現畸形、胚體卵黃囊一直保持圓球形等特征(正常湘云金鳙苗卵黃囊隨胚體發育拉長)，發育到攝食期即被淘汰。因此，以異源四倍體鯽鯉產生的二倍體精子可以作為異源精子刺激源，以誘導湘云金鳙進行雌核發育，但不會產生存活的雜交苗而影響后期的實驗統計和觀察。另外，經過我們長期的實驗后發現，經適度滅活后的異源四倍體鯽鯉精子激活但未經過染色體加倍處理的雌核發育湘云金鳙，其胚胎患有明顯的單倍體綜合癥，也不能發育到攝食期(參見圖3)。因此，如果在經過二倍化處理的試驗中有發育到攝食期的魚苗，即可判定為是雌核發育的二倍體湘云金鳙魚苗(參見圖4)。可見，上述本發明的技術方案大大提高了人工誘導雌核發育湘云金鳙的孵化率和成活率，為高效率、大批量制備雌核發育湘云金鳙純系群體提供了基本的前提。上述各個培育方法制備得到的雌核發育湘云金鳙群體均為雌性，在獲得雌核發育湘云金鳙的基礎上，為獲得兩性可育的雌核發育湘云金鳙，本發明上述的第一種和第二種培育方法在步驟(2)中開始對獲得的雌核發育湘云金鳙進行孵化、飼喂，飼喂的飼料中含有雄性激素物質(MT)，持續到飼喂周期所要求的天數后，投喂不含雄性激素的普通飼料至性成熟，這樣可獲得成功性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙(參見圖5)。然后再用上述雌核發育方法得到的雌核發育湘云金鳙(雌性)與通過性反轉的雌核發育湘云金鳙(雄性)進行自交即可獲得湘云金鳙純系群體，從而使雌核發育湘云金鳙的體色等性狀能夠穩定地遺傳。此夕卜，由于步驟(I)中的刺激源為鯽鯉雜交二倍體精子，其產生的“異精”效益還有利于篩選優質高效、抗逆性強的雌核發育湘云金鳙，扭轉現有湘云金鳙因近親交配導致的品系退化現象。作為另一種改進，在獲得雌核發育湘云金鳙的基礎上，上述第三種和第四種培育方法則省去了性反轉的培育 步驟，直接以上述步驟(I)制備得到的雌核發育湘云金鳙(雌性)作為母本，以普通湘云金鳙(雄性)作為父本,使該母本和父本進行雜交(雌核發育湘云金鳙早X普通湘云金鳙 )，通過該雜交方法同樣能夠獲得體色穩定、生長速度快、抗病能力強的雌核發育湘云金鳙后代Fp而此種方法的操作步驟更為簡便，繁殖效率更高。上述的各種湘云金鳙純系群體的培育方法中，所述適度滅活的具體操作優選為:先用Hank’ s液稀釋異源四倍體鯽鯉的精液，再通過紫外線滅活，滅活程度以鏡檢時精子尾部擺動減弱且80% 90%的精子仍具有良好的游動活力為標準。異源四倍體鯽鯉產生的二倍體精子包含紅鯽和鯉魚的兩套染色體組，頭部明顯比普通二倍體鯉魚產生的精子要大，在經紫外線照射滅活過程中，在顯微視野下更容易判斷被照射精子的滅活程度，一般可以前述的鏡檢精子尾部擺動較滅活前稍有減弱且80% 90%的精子仍具有良好的游動活力為標準。可見，異源四倍體鯽鯉精子是一種既具備遺傳篩選標記、又易于控制精子適度滅活且可適用于湘云金鳙雌核發育操作的優良刺激源。在適度滅活的過程中，所述紫外線滅活時優選使用的是功率為15W的紫外燈(兩盞)，所述紫外燈與所述精液的距離優選為IOcm 12cm，所述紫外燈的照射時間優選為20min 35min。用上述紫外線照射處理的方式進行滅活，時間較鯉魚更短，在批量處理精液時更容易掌握。用該處理方式滅活后的異源四倍體鯽鯉二倍體精子激活湘云金鳙卵子，不產生雜交魚苗，“異精”效益更加明顯，誘導效果非常好。上述的各種湘云金鳙純系群體的培育方法中，所述流水控溫孵化時的溫度為23 26 。與現有技術相比，本發明的優點在于:首先，本發明大大提高了雌核發育二倍體湘云金鳙的孵化率和存活率；第二，本發明培育方法中選用的精子為異源四倍體鯽鯉二倍體精子，具有更好的“異精”效益；第三，異源四 倍體鯽鯉二倍體精子用紫外線照射處理所需要的時間較鯉魚精子短，便于對大量精子進行批量處理；另外，本發明中鑒別雌核發育二倍體湘云金鳙的方法非常簡單，遠緣雜交體及單倍體在外形上可區別于雌核發育二倍體湘云金鳙，且均不能存活至攝食期，確保了存活個體均為雌核發育二倍體湘云金鳙。需要特別指出的是，人工誘導雌核發育技術是本發明培育方法的基礎，適度控制精子滅活以及減少卵子質量受損的人工雌核發育方法，可以顯著提高人工誘導雌核發育湘云金鳙的生產效率，但其在本發明中應用更重要的是為了解決了雌核發育湘云金鳙在大規模推廣應用中的近親交配問題，解決湘云金鳙的基因衰退、品種退化問題，以更好地保證湘云金鳙這一優良品系地穩定遺傳和大規模建立，這與常規雌核發育技術僅僅是為了獲得異精效應的雜種優勢或者為了得到其他新型雜交魚品系存在顯著區別。本發明的培育方法中通過人工性反轉技術獲得雄性的雌核發育湘云金鳙，使其與雌核發育二倍體湘云金鳙自交，進而得到了體色穩定遺傳、且具有優良性狀的雌核發育湘云金鳙純系群體，確保了雌核發育湘云金鳙的規模化生產。本發明的培育方法為大規模建立雌核發育湘云金鳙純系群體提供了解決方案，同時也為相關生物學理論研究提供了重要的群體基因庫。本發明的培育方法在雌核發育湘云金鳙優良苗種繁殖、性別控制和全雌育種上具有重大應用價值和廣闊的推廣應用前景。
圖1為普通湘云金鳙母本的實物照片(體色呈現桔紅色)。圖2為普通湘云金鳙自交子代的實物照片(體色由桔紅色變淡)。圖3為經過精子激活但未經過染色體加倍處理的雌核發育湘云金鳙魚苗外形圖。圖4為經過精子激活且經過染色體加倍處理的雌核發育湘云金鳙魚苗外形圖。圖5為本發明培育方法獲得的I齡雄性雌核發育湘云金鳙的外觀照片。圖6為本發明培育方法獲得的I齡雌性雌核發育湘云金鳙的外觀照片。圖7為本發明實施例中獲得的抑制第二極體排出的雌核發育湘云金鳙染色體圖。圖8為本發明實施例中獲得的抑制第一次卵裂的雌核發育湘云金鳙染色體圖。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但并不因此而限制本發明的保護范圍。實施例:一種本發明的湘云金鳙純系群體的培育方法，具體包括以下步驟:1.精子滅活:擠出達到性成熟的異源四倍體鯽鯉(異源四倍體鯽鯉魚購自湖南湘云生物科技有限公司，其培育方法可參見CN1263704A號中國專利文獻)精液于培養皿中，用Hank’ s液稀釋異源四倍體鯽鯉的精液，Hank’ s液與精液的體積比為3: 1，稀釋后的精液在培養皿中以薄層分布，把盛精液的培養皿放在墊有冰袋的搖床上進行離心處理，轉速為45r/min，并置于兩支功率分別為15W的紫外燈下照射處理，紫外燈與精液的距離為11cm，照射時間為30min，鏡檢時精子尾部擺動減弱且約85%的精子仍具有良好的游動活力，此時將滅活好的精液避光置于4°C冰箱中保存。Hank’ s 液的配方如下:KCL 0.40g、NaCl 8.00g、NaHCO3 0.35g、KH2PO4 0.06g、Na2HPO4.7H20 0.09g、Na2HPO4.12H20 0.10g、MgSO4.7H20 0.10g、MgCl2.6H20 0.10g、CaCl20.14g和葡萄糖(Glucose) 1.0Og ;加蒸懼水配至1L。2.卵子激活:將步驟I中經紫外線照射處理過的精液與湘云金鳙的成熟卵子混合，并用干凈的鵝毛將其充分攪拌混勻，Imin內加入清水(水溫為23°C 26°C)，并開始計算激活時間，卵子激活率可達92%以上。3.染色體加倍處理:本實施例采用冷休克方法抑制第二極體排出和抑制第一次卵裂使激活卵染色體恢復二倍性。通過設置溫度梯度和處理時間對比試驗(見表I和表2)，獲得了最佳的工藝處理參數，即:激活后3min，用5°C水冷休克處理12min，以抑制第二極體排出，激活卵子過原腸率可達62%以上，雌核發育湘云金鳙出苗率可達31%以上；或者，激活后24min，用5°C水處理13min，以抑制第一次卵裂，激活卵子過原腸率可達48%以上，雌核發育湘云金鳙出苗率可達8 .0%。表1:不同冷休克溫度對湘云金鳙雌核發育誘導效果的影響
權利要求
1.一種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟: (1)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子激活湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°c 26°C條件下，激活后2min 4min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min,然后經流水控溫孵化,制備得到抑制第二極體排出的雌核發育湘云金鳙； (2)獲得雄性雌核發育魚:經步驟(I)后獲得的雌核發育湘云金鳙孵化數天后，投喂含雄性激素的飼料，滿足投喂周期的要求后，用不含雄性激素的普通飼料喂養至性成熟，獲得性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙； (3)自交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以步驟(2)中獲得的雄性雌核發育湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行自交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。
2.—種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟: (1)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子刺激湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°C 26°C條件下，激活后21min 24min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min,然后經流水控溫孵化,制備得到抑制第一次卵裂的雌核發育湘云金鳙； (2)獲得雄性雌核發育魚:經步驟(I)后獲得的雌核發育湘云金鳙孵化數天后，投喂含雄性激素的飼料，滿足 投喂周期的要求后，用不含雄性激素的普通飼料喂養至性成熟，獲得性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙； (3)自交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以步驟(2)中獲得的雄性雌核發育湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行自交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。
3.根據權利要求1或2所述的湘云金鳙純系群體的培育方法，其特征在于:所述步驟(2)中，雄性激素選用17 α-甲基睪丸酮，且每克飼料中含有40yg 60yg的17α-甲基睪丸酮。
4.根據權利要求3所述的湘云金鳙純系群體的培育方法，其特征在于:所述步驟(2)中，雌核發育湘云金鳙孵化的天數為4 6天，飼料的投喂周期為80 100天。
5.一種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟: (1)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子激活湘云金鳙的成熟卵子，在水溫為23°C 26°C條件下，激活后2min 4min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min,然后經流水控溫孵化,制備得到抑制第二極體排出的雌核發育湘云金鳙； (2)雜交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以普通的雄性湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行雜交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。
6.一種湘云金鳙純系群體的培育方法，包括以下步驟: (I)人工誘導雌核發育:以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子作為刺激源，使經適度滅活后的該二倍體精子刺激湘云金鳙的成熟卵子，激活后21min 24min用4°C 6°C的水冷休克處理IOmin 13min，然后經流水控溫孵化，制備得到抑制第一次卵裂的雌核發育湘云金鳙； (2)雜交:對步驟(I)中獲得的雌核發育湘云金鳙飼喂至性成熟，然后以該性成熟的雌核發育湘云金鳙作為母本，以普通的雄性湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行雜交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。
7.根據權利要求1 6中任一項所述的湘云金鳙純系群體的培育方法，其特征在于，所述適度滅活的具體操作為:先用Hank’s液稀釋異源四倍體鯽鯉的精液，再通過紫外線滅活，滅活程度以鏡檢時精子尾部擺動減弱且80% 90%的精子仍具有良好的游動活力為標準。
8.根據權利要求7所述的湘云金鳙純系群體的培育方法，其特征在于，所述紫外線滅活時使用的是功率為15W的紫外燈，所述紫外燈與精液的距離為IOcm 12cm，所述紫外燈的照射時間為20min 35min。
9.根據權利要求1 6中任一項所述的湘云金鳙純系群體的培育方法，其特征在于，所述流水控溫孵化時的 溫度為23°C 26°C。
全文摘要
本發明公開了湘云金鳙純系群體的培育方法，包括先以異源四倍體鯽鯉的二倍體精子激活湘云金鳙的卵子，激活后冷休克處理，然后經流水控溫孵化，制得雌核發育湘云金鳙；孵化數天后投喂含雄性激素的飼料，獲得性反轉的雄性雌核發育湘云金鳙；然后以雌核發育湘云金鳙作為母本，以雄性雌核發育湘云金鳙作為父本，自交后獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。另外，本發明的培育方法還可以雌核發育湘云金鳙作為母本，以普通的雄性湘云金鳙作為父本，使該母本與父本進行雜交，進而獲得雌核發育的湘云金鳙純系群體。本發明的方法能大大提高魚苗孵化率和存活率，且能培育出體色穩定、性狀優良的湘云金鳙純系群體。
文檔編號A01K61/00GK103190366SQ20131011273
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者孫遠東, 周工健, 劉少軍, 楊福忠, 譚樹華, 張小立, 李夢軍 申請人:湖南湘云生物科技有限公司