專利名稱：一種水稻抗稻瘟病基因Pi9的功能分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農作物分子遺傳育種學領域，具體涉及一種水稻抗稻瘟病基因的功能分子標記及其應用。
背景技術：
水稻是我國最重要的糧食作物之一，其對保障我國糧食安全具有至關重要的意義。長期以來，水稻生產遭受一些病蟲害的嚴重威脅。稻瘟病是世界范圍內對水稻生產危害最嚴重的病害之一，其危害不但降低水稻產量，而且影響稻米品質，給水稻生產造成嚴重損失。長期的生產實踐表明，培育和合理利用抗病品種是控制稻瘟病最經濟有效和對環境安全的途徑。近60多年以來，各國科學家從多種水稻抗病資源中鑒定了 70多個抗病基因，一些抗稻瘟病基因也已被應用到水稻抗病育種中。由于不同抗病基因間存在一定的抗譜重疊性，常規育種方法存在表型鑒定困難、選擇效率扁低的局限性，尤其難以實現多個抗病基因聚合在同一品種中。通過分子標記輔助選擇可以克服這一困難。近年來，不少抗性基因已被精細定位或被克隆，與這些基因緊密連鎖的SSR或其它分子標記的應用促進了多抗病基因聚合育種的發展。另一方面，基因克隆的結果顯示抗病基因往往是成簇存在，且不同復等位基因之間、功能型序列與非功能型之間序列高度同源，一般的連鎖標記仍然難以準確甄別各種抗病功能基因，且存在一定的預測誤差率。基于功能基因DNA序列與其等位非功能基因DNA序列之間特異多態性的功能標記(Functional marker)是一種可以直接判斷某一特定功能基因存在與否的標記，開發和應用抗病基因的功能標記可以大大提高分子標記輔助選育多抗病基因聚合水稻品種的效率。
是一個抗譜很廣的抗病基因。研究表明，該基因對來自13個國家的43個稻瘟病菌株均表現出很高的抗性(Liu et al.2002)。位于第6染色體，這一位點同時還實有Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi26(t)、P1-40 (t)和⑷等多個復等位基因。開發/ 夕基因的功能分子標記，對充分利用這一抗性基因，改良我國水稻抗病性有重大意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種水稻抗稻瘟病基因的功能分子標記及其應用。通過檢測該功能分子標記，可以準確判斷所選擇水稻植株是否具有抗病基因Pi9，加快抗稻瘟病水稻品種選育進度。本發明通過功能基因與非功能等位序列相比，發現水稻抗稻瘟病功能基因存在一個IObp的插入/缺失位點，位于該基因啟動子-516/-517間，核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示。由此本發明提供了一種用于鑒別水稻抗稻瘟病功能基因的引物組合，所述引物組合由如SEQ ID N0.2所示的DNA序列和如SEQ ID N0.3所示的DNA序列組成。正向引物F9-F序列是5 ' -TGATTATGTTTTTTATGTGGGG-3 '，反向引物F9-R序列是5' -ATTAGTGAGATCCATTGTTCC-3;。根據上述引物組合，本發明還提供了一種建立水稻抗稻瘟病基因功能分子標記的方法，包括以下步驟:
1)提取水稻樣品基因組DNA；
2)利用所述的引物組合對水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，根據擴增產物是否為一條128bp條帶，判斷其樣品基因組是否具有功能基因，即如果能夠擴增出一個128bp的標記片段，則標志著其樣品基因組存在抗稻 瘟病基因/具體方案如下:
1)取水稻葉片組織，提取水稻樣品的基因組DNA；
2)利用引物組合F9-F/F9-R對水稻樣品DNA進行PCR擴增；
3)PCR擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺膠上進行電泳檢測，如果擴增產物是一個128bp的標記片段，則標志所檢測水稻植株具有抗稻瘟病Pi9功能基因。本發明另外保護了所述引物組合在選育抗稻瘟病水稻中的應用，其通過以下步驟:
O以攜帶抗稻瘟病功能基因的水稻抗病品系75-1-127或其衍生系與其他水稻品種雜交或回交并繁衍后代群體；
2)提取上述所獲得群體中單個植株的基因組DNA，用所述引物組合進行PCR反應，如果能夠擴增出一個128bp的標記片段，則標志著所檢測水稻植株存在抗稻瘟病基因本發明的有益效果:
本發明通過比較水稻抗稻瘟病產相功能基因和非功能產相等位基因間的DNA序列，在Pi9功能基因啟動子區確定了一個特有的缺失多態性，并開發了基于PCR引物組合F9-F/F9-R的功能標記。通過該功能性分子標記可以準確檢測不同水稻品種的基因組中是否含有Ρ 9功能基因以及其純合狀態，可應用于篩選水稻雜交轉育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的選育效率，獲得含Pi9功能基因的抗稻瘟病水稻品種。I)本發明提供的標記位于A 沒基因的啟動子區，在遺傳上與抗病性呈共分離，選擇效率達到100%。前人報道的標記均與基因存在一定的遺傳距離，用于選擇基因時存在一定的預測誤差率。2)本發明提供的標記是一種共顯示標記，準確性高、重復性好，并且能夠區分出雜合體和純合體，可以快速獲得具有純合功能基因的抗稻瘟病水稻植株。3)應用本發明提供的標記選育具基因的抗稻瘟病水稻品種，具有選擇目標明確，選擇效率高以及節約成本的優勢。在常規水稻抗病育種中，一般是根據育種材料在苗期或抽穗期所表現出來的抗瘟性狀進行選擇，其受環境影響較大，不同年份間差別也較大，篩選鑒定的可靠性低。常規方法應用于聚合多抗病基因材料育種尤其受限制。其原因在于不同抗病基因間存在一定的抗譜重疊性，常規表型篩選到的材料并不一定同時聚合多抗性基因。基于本發明提供的抗稻瘟病基因/功能分子標記，可以在苗期取樣，提取水稻植株DNA,通過PCR快速鑒定出攜帶功能基因單株，能夠有效控制育種群體規模，顯著節約育種篩選成本。通過結合應用其它抗病基因標記，Ρ 9功能分子標記還能應用于水稻聚合多抗病基因育種，提高水稻抗稻瘟病株系選擇效率。
圖1為部分水稻品種等位基因啟動子區序列分析。其中，75-1-127:75-1-127 ；NPB:日本晴；9311:9311 ;D62_B:D62A ;TF_B:天豐A ；SE21S:SE21S ;G46_B:岡 46A ；MH63:明恢 63 ；MY46:密陽 46 ;J23_B:金 23A ；GH998:廣恢 998 ；GF-B:谷豐 A ；F838:輻 838 ；C64:測 64 ；SH527:蜀恢 527 ；PA64S:培矮 64S ;II3_B:I1-32A ；GZ63S:廣占 63S ；ZGB:早岡 A ；LTP-B:龍特浦 A ；02428:02428 ；C039:C039。圖2為基于F9-F/F9-R引物組合功能分子標記檢測部分水稻品種基因組DNA的電泳圖譜。其中，M:分子量 Marker ；1:75-1-127 ；2:日本晴；3:9311 ；4:D62A ；5:天豐 A ；6:SE21S ；7:岡 46A ；8:明恢 63 ；9:密陽 46 ；10:金 23A ；11:廣恢 998 ；12:谷豐 A ;13:輻 838 ；14:測 64 ；15:蜀恢 527 ；16:培矮 64S ；17:1I_32A ；18:廣占 63S ；19:早岡 A。含有/ 沒功能基因的75-1-127樣本顯示一條128bp條帶，其它攜帶/7^非功能等位基因品種的樣本顯示一條137bp或138bp的條帶。
具體實施例方式 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。以下實施例用于說明本發明而不限制本發明的范圍。實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1 功能基因序列標記性結構確定
通過分析來源于水稻品種75-1-127的功能基因區段序列(Genbank DQ454157)和來源于水稻品種日本晴的非功能/7ZP等位區段序列(Genbank DQ454158),發現在啟動子區域，兩者具有較多差異。進一步針對功能基因啟動子-7至-793區段設計特異性引物組合 Pro9-F: 5’-CGGTTATAGATGAATATAGTTC-3’，Pro9-R: 5’-GTTCGACTCTCCCTTCAAGC-3’，以攜帶產相功能基因水稻品種75-1-127基因組DNA以及其它27個水稻品種(日本晴、9311、02428、BL123、麗江團黑谷 、Katy、珍97A、龍特浦A、早岡A、I1-32A、谷豐A、天豐A、D62A、岡46A、金23A、廣占63S、明恢63、蜀恢527、明恢86、ZR101、廣恢998、輻838、測64、密陽46、SE21S、培矮64S、C039)基因組DNA為模板，進行PCR擴增并對PCR產物測序。分析上述28個水稻品種PCR產物測序結果，發現非功能等位區段均在相對應于功能基因啟動子-516/-517間，具有一個序列為5’ -YGATGGTTTC-3’(其中Y代表堿基C或者T)的IObp插入片段，(附圖1顯示部分品種序列分析結果)，即功能基因在其啟動子區存在一個IObp大小的標記性缺失。實施例2 功能分子標記建立
根據/功能基因啟動子區與等位非功能/7^相應區段的測序分析結果，設計了一對特異性引物組合 F9-F: 5 ' -TGATTATGTTTTTTATGTGGGG-3 '，F9-R:5’ -ATTAGTGAGATCCATTGTTCC-3’。F9_F/ F9-R引物組合特異性對應Ρ 9功能基因啟動子-451至-578序列，擴增片段包括了功能基因啟動子-516/-517的特異性缺失位點(附圖1)。利用F9-F/ F9-R引物組合對28個水稻品種75-1-127、日本晴、9311、02428、BL123、麗江團黑谷、Katy、珍97A、龍特浦A、早岡A、I1-32A、谷豐A、天豐A、D62A、岡46A、金23A、廣占63S、明恢63、蜀恢527、明恢86、ZR101、廣恢998、輻838、測64、密陽46、SE21S、培矮64S、C039的基因組DNA進行PCR擴增。PCR 反應體系為 25 μ L，含有模板 DNA 50 ng，2 X Reaction Mix 12.5 μ L (含MgCl2、dNTP 等)，10 “] 引物卩9-卩和卩9-1 各1 yL，0.5U Golden DNA Polymerase (2.5U/12.5 μ L，TIANGEN生物技術公司)，ddH20補齊至25 μ L0反應條件為:94°C 5min，94°C 30S,58°C 30S,72°C 30S，共30個循環，最后72°C延伸8 min。擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分型。實施例結果表明，含有功能基因的75-1-127樣本顯示一條128bp條帶,其它攜帶非功能等位區段品種的樣本顯示一條137bp或138bp的條帶(附圖1顯示部分品種擴增樣品凝膠電泳分析結果)，兩者帶型可以在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中明顯區分開。該標記是一個共顯示標記，可以檢測出水稻植株是否攜帶功能基因以及以及其基因型是純合或雜合，即如果擴增產物是128bp的單一標記片段，標志著水稻植株染色體中的基因是純合的，如果擴增產物是包含一個128bp片段和一個137bp或138bp片段，則標志著水稻植株染色體中的基因是雜合型。實施例3 功能分子標記驗證及應用
以不含功能基因的水稻品種日本晴和功能基因供體品種75-1-127為親本配置F2群體，以稻瘟菌菌株KJ201對F2群體247個植株進行苗期人工接種，獲得了 176個抗性植株。提取這些抗性植株的基因組DNA，以引物組合F9-F/F9-R進行PCR擴增，擴增產物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分型。實施例結果表明，176個抗性植株的PCR擴增樣品均能檢測到代表功能基因的128bp特異條帶，選擇效率達到100%。利用75-1-127和水稻恢復系閩恢3301配置組合，將產相功能基因向閩恢3301轉育。配組并篩選獲得了 BC3F1代材料。利用引物組合F9-F/F9-R對BC3F1代植株的基因組DNA進行PCR擴增，檢測到20個單株的樣品具有代表功能基因的128bp特異條帶，與這些單株的抗病性生物學鑒定結果一致。應用功能分子標記能夠快速準確鑒定出攜帶 基因的水稻植株，加速水稻抗稻瘟病品種培育的進程。
權利要求
1.一種水稻抗稻瘟病基因/7^的功能分子標記，其特征在于:水稻抗稻瘟病功能基因Z7^存在一個IObp的插入/缺失位點，位于該基因啟動子-516/-517間，核苷酸序列如SEQID N0.1 所示。
2.一種用于鑒別水稻抗稻瘟病功能基因的引物組合，其特征在于:所述引物組合由如SEQ ID N0.2所示的DNA序列和如SEQ ID N0.3所示的DNA序列組成。
3.一種建立水稻抗稻瘟病基因功能分子標記的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)提取水稻樣品基因組DNA； 2)利用權利要求2所述的引物組合對水稻樣品基因組DNA進行PCR擴增，根據擴增產物是否為一條128bp條帶，判斷其樣品基因組是否具有功能基因，S卩如果能夠擴增出一個128bp的標記片段，則標志著其樣品基因組存在抗稻瘟病基因
4.如權利要求2所述的引物組合在選育抗稻瘟病水稻中的應用，其通過以下步驟: O以攜帶抗稻瘟病功能基因的水稻抗病品系75-1-127或其衍生系與其他水稻品種雜交或回交并繁衍后代群體； 2)提取上述所獲得群體中單個植株的基因組DNA，用權利要求2所述引物組合進行PCR反應，如果能夠擴 增出一個128bp的標記片段，則標志著所檢測水稻植株存在抗稻瘟病基因 Ρ 9。
全文摘要
本發明提供了一種水稻抗稻瘟病基因Pi9的功能分子標記及其應用，屬于農作物分子遺傳育種學領域。本發明通過發現水稻抗稻瘟病功能基因Pi9存在一個10bp的插入/缺失位點，位于該基因啟動子-516/-517間，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，并在此基礎上開發了Pi9基因的功能分子標記的方法。通過檢測該功能分子標記，可以準確檢測不同水稻品種的基因組中是否含有Pi9功能基因以及其純合狀態，可應用于篩選水稻雜交轉育后代植株，提高水稻抗稻瘟病材料的選育效率，有效控制育種群體規模，顯著節約育種篩選成本，獲得含Pi9功能基因的抗稻瘟病水稻品種。
文檔編號A01H1/04GK103146695SQ201310065310
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優先權日2013年3月1日
發明者陳松彪, 王 鋒, 田大剛, 陳在杰, 林艷, 宋亞娜, 胡昌泉 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所