專利名稱：一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法
技術領域：
本發明“一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法”，是由芋頭莖尖離體條件下組織培養獲得試管苗，屬于生物技術領域。
背景技術：
江蘇省擁有較多地方特色芋頭品種，具有較好的營養保健品質，并含有多種維生素，既可以當糧食，又可做蔬菜，是老幼皆宜的滋補品，加工前景廣闊，聞名并暢銷國內外市場。目前，江蘇省地方特色芋頭的生產通常是采用群眾自留種的方式進行繁殖，種性退化問題較為突出，抗病性和抗逆性減退。而且，國內對其組培快繁技術方面研究很少，因此開展江蘇省地方特色芋頭組培再生體系技術研究，不僅有利于品種的更新復壯，更為種苗工廠化生產和新品種選育提供技術支持與儲備。目前，芋頭組織培養研究國內外均有報道，但多以莖尖誘導愈傷組織為研究內容，不利于保持品種的穩定性。本發明利用莖尖離體條件獲得試管苗，易于保持品種種性，同時可明顯提高繁殖系數和繁殖速度，加快了快繁進程，保持了品種的優良特性，有效地保護了具有地方特色的種質資源。
發明內容
技術 問題
本發明的目的是找到既能提高芋頭繁殖系數和繁殖速度，又能保持該品種穩定性的方法，此方法具有繁殖系數高、繁殖速度快、繁殖效率高，種苗病毒少，遺傳穩定性好變異率低等優點，可以彌補現有繁殖方式成本高、系數低、愈傷組織誘導組培苗繁瑣、時間長、變異率高的缺點，從而為芋頭種苗擴繁提供一種新的方法。技術方案1、一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法，包括以下步驟:
(I)外植體的準備:選取保存完好，無腐爛斑點的芋，經0.2%的K2MnO4消毒5min后整齊地排列在周轉箱中，用沙子覆蓋到整個芋塊的2/3處，放置到光照培養箱中待其萌發。(2)外植體的滅菌:當芽生長到l-3cm時切取莖尖，剝除莖尖外層2_3層葉片，流動水沖洗IOmin左右，在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液滅菌10_15min，無菌水漂洗5-7次。(3)芽的誘導分化:外植體經滅菌后接種在添加TDZ濃度為0.5mg/L的基本培養基中，20d即可長成兩片或兩片葉片以上的幼苗。(4)繼代增殖:誘導培養基上萌發出的不定芽長到2.0cm的時候，接種在添加TDZ濃度為1.0mg/L的基本培養基中，一般連續繼代3-5次。(5)生根培養:將高2.0 cm以上、帶有2片葉的健壯小苗切下，轉入生根培養基上進行培養，生根培養基成分為1/2MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L +6-BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L ;培養30d左右即可形成完整的組培苗。(6)培養條件:培養室溫度為25±2°C，光照強度1200-15001x，每天光照12h。基本培養基為MS中添加瓊脂7 g /L，添加蔗糖30g/L。其中MS培養基為M0222.0050培養基。
有益效果
本發明第一次利用組織培養的方法解決具有江蘇地方特色的芋頭種芋快繁問題。本發明利用芋莖尖離體條件下獲得試管苗，有利于實現芋頭種苗繁殖工廠化生產。本發明具有繁殖系數高、繁殖速度快、繁殖效率高，種苗病毒少、遺傳穩定性好的特點。本發明利用芋莖尖初代培養20天左右即可長成兩片或兩片葉片以上的幼苗，大大提高了初代培養的進程，繼代培養一次增殖系數平均達到4.3，一般可連續繼代5次，培養1470株苗(4.35=1470)，一年可以培養2批，形成組培種芋2940株，有利于芋大規模商品化生產；此方法也有易于獲得遺傳穩定性好變異率低的再生植株。
附圖1初代培養；
附圖2繼代增殖；
附圖3生根培養；
附圖4組培苗。
具體實施例方式下面通過基于中國地理標志性農產品靖江香沙芋莖尖離體條件下獲得試管苗進一步說明本發明。I材料與方法1.1試驗材料
采用盆栽芋頭，選用莖尖為外植體。1.2 方法1.2.1無菌材料的處理
選取保存完好，無腐爛斑點的芋，經0.2%的K2MnO4消毒5min后整齊地排列在周轉箱中，用沙子覆蓋到整個芋塊的2/3處，放置到光照培養箱中待其萌發。待芽生長到l-3cm時切取莖尖，剝除外層2-3層葉片，流動水沖洗IOmin左右，在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，分別用兩種消毒劑3個時間段處理殺菌，每種處理分別接種12個莖尖于基本培養基中，觀察殺菌效果。基本培養基為MS中添加瓊脂7g/L和蔗糖30g/L。MS為M0222.0050培養基(荷蘭 Duchefa Biochemie 公司)。①用84消毒液(江蘇愛特福氣霧劑有限公司)分別浸泡10、15、20min，比較其污染率；
②用5%的NaClO分別浸泡5、10、15min，比較其污染率。1.2.2芽誘導分化
外植體經滅菌后接種在添加不同濃度的6-BA和NAA組合及TDZ (噻苯隆)和IBA (口引哚丁酸)組合的基本培養基中，接種30d后比較芽的分化率、芽高度及葉片數等確定合適的培養基。激素濃度設置7個處理，每個處理各接種15個芽。①基本培養基+6-BA 0.5mg/L +NAA 0.2mg/L ；
②基本培養基+6-BA1.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
③基本培養基+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
④基本培養基+6-BA 4.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
⑤基本培養基+TDZ0.5mg/L ；
⑥基本培養基+TDZ1.0mg/L ；
⑦基本培養基+TDZ1.0mg/L +IBA 0.4mg/L。
1.2.3繼代增殖
誘導培養基上萌發出的芽體長到一定的程度后接種在添加不同濃度的6-BA和NAA組合及TDZ的基本培養基中觀察其增殖倍數。激素濃度設置3個處理，每個處理各接種20個單牙。①基本培養基+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
②基本培養基+TDZ0.5mg/L ；
③基本培養基+TDZ1.0mg/Lo1.2.4生根培養
將高2.0 cm以上、帶有2片葉的健壯小苗切下，轉入生根培養基上進行培養。調查不同處理的平均生根天數，30d的生根數，生根率，總葉片數，根系平均長度及根系形態。生根培養基設置4個處理，每個處理各接種15個小苗。①1/2MS+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 0.5mg/L ；
②1/2MS+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA1.0mg/L ；
③1/2MS+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 2.0mg/L ；
④1/2MS+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 4.0mg/L。1.2.5培養基滅菌及培養條件
高壓滅菌前用濃度0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調整培養基pH值至5.8，保持121°C滅菌20min。培養室溫度為25±2°C，光照強度1200_15001x，每天光照12h/d。2結果與分析
2.1不同消毒液和滅菌時間對外植體滅菌效果的影響
從表I可以看出，外植體用84消毒液滅菌10-15min效果最好，滅菌成功率達83.3%以上。NaClO滅菌成功率，遠遠低于84消毒液滅菌成功率。因此，外植體的滅菌方法為:當芽生長到l-3cm時切取莖尖，剝除莖尖外層2-3層葉片，流動水沖洗IOmin左右，在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液滅菌10-15min，無菌水漂洗5_7次。
表I不同消毒液和滅菌時間對外植體滅菌效果的影響
權利要求
1.一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法，包括以下步驟: (1)外植體的準備:選取保存完好，無腐爛斑點的芋，經質量比0.2%的K2MnO4消毒5min，用沙子覆蓋到整個芋塊的2/3處，放置到光照培養箱中待其萌發； (2)外植體的滅菌:當芽生長到l-3cm時切取莖尖，剝除莖尖外層2-3層葉片，流動水沖洗lOmin，在超凈臺上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液滅菌10_15min，無菌水漂洗5_7次； (3)芽的誘導分化:外植體經滅菌后接種在添加TDZ濃度為0.5mg/L的基本培養基中，20d即長成兩片或兩片葉片以上的幼苗； (4)繼代增殖:誘導培養基上萌發出的不定芽長到2.0cm的時候，接種在添加TDZ濃度為1.0mg/L的基本培養基中，一般連續繼代3-5次； (5)生根培養:將高2.0 cm以上、帶有2片葉的健壯小苗切下，轉入生根培養基上進行培養，生根培養基成分為1/2MS+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L +6-BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L ； 上述步驟培養條件:培養室溫度為25±2°C，光照強度1200-15001x，每天光照12h，基本培養基為MS中添加瓊脂7g/L，蔗糖30g/L。
2.根據權利要求1所述的一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法，其中MS為M0222.0050 培養基。
全文摘要
本發明公開了一種利用芋頭莖尖進行組織培養的快繁方法，屬于生物技術領域。選取無病菌的芋莖尖為外植體，經過芽的誘導、繼代增殖、生根培養等一系列操作步驟，最后形成完整的試管苗。此方法包括上述各階段培養基成分以及誘導培養的處理方法，本發明利用芋莖尖初代培養20天左右即可長成兩片或兩片葉片以上的幼苗，大大提高了初代培養的進程，繼代培養一次增殖系數平均達到4.3，一般可連續繼代5次，培養1470(4.35)株苗，一年可以培養2批，形成組培種芋2940株，有利于芋大規模商品化生產；此方法也有易于獲得遺傳穩定性好變異率低的再生植株。
文檔編號A01H4/00GK103070078SQ20131004782
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月7日 優先權日2013年2月7日
發明者韓曉勇, 殷劍美, 張培通 申請人:江蘇省農業科學院