專利名稱：一種洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法
技術領域：
本發明涉及一種洋桔梗游離小孢子誘導獲得單倍體植株的方法，屬于花卉育種技術領域。
背景技術：
洋桔梗又名草原龍膽,為龍膽科草原龍膽屬植物,花姿雅麗，花形別致，花色豐富，嬌而不艷，瓶插期長、耐長途運輸，莖桿光滑挺直，葉片油綠，具有較高的觀賞價值和經濟價值，是世界上十分流行的高檔切花之一，現已躋身世界十大切花之列。
洋桔梗是異花授粉植物，容易授粉，種子量多，自交存在衰退現象，但自交系之間雜交種(F1)表現出強雜種優勢，因此，國外引進洋桔梗品種F1代雜交種子后代分離嚴重，不能留種種植。在我國，每年都需從國外大量進口洋桔梗種苗，從而導致洋桔梗生產成本高， 為此，培育我國具有自主知識產權的洋桔梗新品種具有重大意義。
在雜種優勢利用中，親本必須是純合的自交系，經組配后才能得到性狀整齊一致具有強雜種優勢的雜交種。洋桔梗采用常規的育種方法選育自交系，獲得一個純系大約需要6 8年，時間長，選擇效率低，耗費大量的人力和物力，再加之洋桔梗為異花授粉，存在自交衰退現象，從而導致洋桔梗自交系的獲得較困難。植物的花粉只帶有一套染色體，是單倍性細胞，通過未成熟花粉(小孢子)培養可以獲得單倍體植株，進而通過染色體加倍成為雙單倍體材料(二倍體純系)，一方面有利于隱性突變或基因重組性狀的表達，另一方面可以直接獲得純合自交系材料，應用于組配雜交種。
通常由小孢子培養來獲得純合材料僅需要I 2年時間，大大縮短自交系選育年限，加速育種進程，提高育種效率，是現代植物育種中快速、高效的育種途徑之一。國內外已有利用小孢子培養獲得植物自交系的報導，但未見洋桔梗小孢子培養獲得單倍體自交系的報導。
盡管洋桔梗的花藥培養獲得再生植株的方法已經有報導(專利號201010133937， 王麗花等，洋桔梗花藥離體培養與完整植株的誘導，西南農業學報，2009，22 (5): 1424-1427)，他們實驗結果表明通過花藥培養獲得的再生株群體的倍性組成比較復雜，以二倍體為主，單倍體所占比例較小，如何提高花藥植株的單倍體再生比率須待進一步研究。 我們通過文獻檢索，發現通過花藥培養獲得的再生植株絕大部分是來自于花藥壁的二倍體細胞，也有可能少量來自單倍性的花粉粒，因此，單倍體出現的頻率很低，甚至沒有，因而， 不能形成足夠的選擇群體，同時也導致再生植株混雜(混倍)，要從這樣的混雜植株中再挑選出單倍體植株費工費時。由此可見，采用花藥培養對洋桔梗F1代種子生產價值不大。
進一步開展洋桔梗小孢子培養技術研究，對解決我國洋桔梗雜交種子生產問題， 具有巨大的潛在商業價值，同時，單倍體植株也是進行分子標記、遺傳圖譜構建 、重要性狀相關基因定位和分子克隆、遺傳工程中遺傳轉化等的理想受體材料。發明內容
本發明的目的在于針對洋桔梗雜交種子后代分離嚴重，難于得到自交系親本植株的技術難題，提供一種高效、實用的洋桔梗單倍體培育方法，為洋桔梗品種改良和新品種選育提供優良的親本自交系材料，解決洋桔梗雜交種子(F1)依賴進口，鮮切花生產成本高等問題，該方法能快速穩定獲得大量單倍體植株。
本發明進一步研究認為由于游離小孢子的單細胞性、單倍性及大群體等特性，使其在單倍體育種上，較花藥培養具有更多的優點數量多、速度快、世代間基因型穩定，可完全避免花藥壁二倍體細胞的干擾，獲得完全真實的單倍體植株(可獲得100%單倍體植株)， 加倍后可獲得穩定的、高度純合的二倍體純系，為雜種優勢利用提供親本，應用于雜交制種能快速獲得性狀整齊具有雜種優勢的F1代雜交種。
為了實現上述目標，本發明采取如下的技術方案(1)確定材料選取具有綜合優良性狀的雜交一代洋桔梗品種作為試驗材料；(2)花蕾選取，預處理，消毒在開花初期，通過熒光染色法在顯微鏡下選取處于單核靠邊期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，用洗潔精清洗花蕾表面，并用清水沖洗干凈；用75%酒精消毒60sec,再用O. 1%的升萊消毒10 15 min,最后用無菌水沖洗3次后，晚干；(3)游離小孢子分離將消毒后花蕾放入含有B5培養基的研缽中研磨，混合液經400目雙層漏斗過濾，收集濾液于IOmL離心管中，IOOOrpm, 5min離心,棄去上清,再加入5 8 mL B5培養基，IOOOrpm, 5min離心，清洗沉淀，重復2次，離心完畢后，加入MS液體培養基于離心管中，用血球計數器統計細胞密度，并調整密度為1. OX IO4 1. OX IO5個/mL，獲得游離小孢子；所述培養基B5培養基經過裝有兩層微孔濾膜的塑料器過濾滅菌；MS的液體培養基MS+3%蔗糖，經121°C高壓滅菌20分鐘；(4)小孢子愈傷組織誘導用移液器移取ImL含有上述小孢子的液體培養基于誘導愈傷組織的MS固液雙層培養基中，溫度為25°C進行黑暗培養；30 40天后，形成愈傷組織， 其中，所述固液雙層培養基為固體層MS +0.8%瓊脂粉+3%蔗糖，液體層MS +0.1 4 mg/L KT +0.1 4 mg/L 2，4_D+3%蔗糖，固體層和液體層分別經121°C高壓滅菌20分鐘；(5)不定芽誘導取上述愈傷組織接種于不定芽誘導培養基MS+0.1 4 mg/L KT +0.1 O. 5 mg/L IBA，光照強度為2000Lx，光照時間為8 13小時/天，溫度為22 27°C 進行培養；30 40天后可見愈傷組織上綠色球型小突起，50 60天后可見萌動的不定芽或叢生小苗。
(6)單倍性植株獲得取上述不定芽或小苗轉入培養基MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/ L NAA,光照強度為2000Lx，光照時間為8 13小時/天，溫度為22 27°C進行培養；20 30天形成完整單倍體植株；(7)再生植株倍性鑒定將根尖放入8-羥基喹啉(濃度為O. 002mol/L)中I天；用移液器取出8-羥基喹啉，用蒸餾水沖洗根尖；將沖洗好的根尖放入到卡諾`氏(無水乙醇冰醋酸 =3:1) 20 24小時，用移液器取出卡諾氏，用蒸餾水沖洗根尖，將根尖放入lmol/L的HCl 中5 20min (嫩的根尖5 IOmin,老的根尖10 20min),用蒸懼水沖洗干凈,用卡寶品紅染色壓片；顯微鏡觀察，確定獲得染色體數目2 η =36的為單倍體植株。國外進口雜交一代洋桔梗對照植株染色體數目2 η =72 ;經鑒定的小孢子植株全為單倍體。形態學鑒定表明小孢子培養獲得的單倍體植株相對于國外進口雜交一代洋桔梗對照植株株型矮小，花蕾不結實，葉片氣孔小等特點。
通過本發明的方法可避免花藥培養帶來的二倍體再生植株的干擾，可獲得大量完全真實的單倍體植株，且比率達到100%，形成足夠大的選擇群體，經秋水仙堿處理后可成為純合自交系。洋桔梗純合自交系的獲得為洋桔梗品種改良和新品種選育提供有力手段，用于雜交種組配可快速篩選出優良的雜交一代(F1),為解決我國洋桔梗種子生產問題，具有巨大的潛在商業價值。
圖1單核靠邊期小孢子顯微鏡圖；圖2小孢子培養形成愈傷組織圖；圖3愈傷組織誘導萌動不定芽圖；圖4愈傷組織誘導叢生苗圖；圖5小孢子培養形成單倍體植株圖；圖6小孢子培養形成單倍體植株染色體顯微鏡圖；圖7國外進口雜交一代洋桔梗植株染色體顯微鏡圖。
具體實施方式
實施例1 :雪萊(香檳色)游離小孢子誘導獲得單倍體植株的方法如下(I)確定材料選取具有綜合優良性狀的雜交一代洋桔梗雪萊(香檳色)作為試驗材料。
(2)花蕾選取，預處理，消毒在開花初期，通過熒光染色法在顯微鏡下選取處于單核靠邊期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，用洗潔精清洗花蕾表面，并用清水沖洗干凈；用75%酒精消毒60sec,再用O. 1%的升萊消毒10 15min,最后用無菌水沖洗3 次后，晾干。
(3)游離小孢子分離將消毒后花蕾放入含有B5培養基的研缽中研磨，混合液經 400目雙層漏斗過濾，收集濾液于IOmL離心管中，IOOOrpm, 5min離心，棄去上清，再加入8 mL B5培養基，IOOOrpm, 5min離心，清洗沉淀，重復2次，離心完畢后，加入MS液體培養基于離心管中，用血球計數器統計細胞密度，并調整密度為1. OX IO4個/mL (或1. OX IO5個/ mL)，獲得游離小孢子；所述培養基B5培養基經過裝有兩層微孔濾膜的塑料器過濾滅菌。
MS的液體培養基MS +3%蔗糖，經121°C高壓滅菌20分鐘。
(4)小孢子愈傷組織誘導用移液器移取ImL含有上述小孢子的液體培養基于誘導愈傷組織的MS固液雙層培養基中，溫度為25°C進行黑暗培養30 40天后，形成愈傷組織。其中，所述固液雙層培養基的配方為固體層MS +0. 8%瓊脂粉+3%蔗糖。
液體層MS+3 mg/L KT +3 mg/L 2，4-D+3% 鹿糖。
所述固體層和液體層分別經121°C高壓滅菌20分鐘。
(5)不定芽誘導取上述愈傷組織接種于不定芽誘導培養基MS+3mg/L KT +0.2mg/L IBA，光照強度為2000Lx，光照時間為8小時/天，溫度為25°C進行培養；30 40天后可見愈傷組織上球型小突起，50 60天可見萌動的不定芽。
(6)單倍體植株獲得取上述不定芽轉入培養基:MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/L NAA, 光照強度為2000Lx，光照時間為8小時/天，溫度為25°C進行培養；20 30天形成完整單倍體植株；(7)再生植株倍性鑒定將上述完整植株的根尖放入8-羥基喹啉(O. 002mol/l)中I 天；用移液器移出8-羥基喹啉，再用蒸餾水沖洗根尖；將沖洗好的根尖放入到卡諾氏(無水乙醇冰醋酸=3:1)20 24小時，用槍取出卡諾氏，用蒸餾水沖洗根尖，將根尖放入lmol/L 的HCl中5 20min (嫩的根尖5_10min,老的根尖10_20min),用蒸懼水沖洗干凈,用卡寶品紅染色壓片；顯微鏡觀察，確定獲得染色體數目2 η =36的單倍體植株，因國外進口雜交一代洋桔梗對照植株雪萊(香檳色)染色體數目2 η =72 ;經鑒定的小孢子獲得的植株全為單倍體。形態學鑒定表明小孢子培養獲得的單倍體植株相對于國外進口雜交一代洋桔梗對照植株株型矮小，花蕾不結實，葉片氣孔小等特點。
實施例2 賽娜(紫色)游離小孢子誘導獲得單倍體植株的方法如下(1)確定材料選取具有綜合優良性狀的雜交一代洋桔梗賽娜(紫色)作為試驗材料；(2)花蕾選取，預處理，消毒與實施例1相同(3)游離小孢子分離與實施例1相同(4)小孢子愈傷組織誘導與實施例1相同，而固體層MS+0. 8%瓊脂粉+3%蔗糖，液體層MS +2 mg/L KT +2 mg/L 2，4_D+3% 蔗糖；(5)不定芽誘導與實施例1相同，但不定芽誘導培養基MS+2mg/LKT +0. 5mg/L IBA ；(6)單倍體植株獲得與實施例1相同(7)再生植株倍性鑒定與實施例1相同。但國外進口雜交一代洋桔梗對照植株為賽娜 (紫色)。
實施例3 神話(紫邊)游離小孢子誘導獲得單倍體植株的方法如下(1)確定材料選取具有綜合優良性狀的雜交一代洋桔梗神話(紫邊)作為試驗材料；(2)花蕾選取，預處理，消毒與實施例1相同(3)游離小孢子分離與實施例1相同。
(4)小孢子 愈傷組織誘導與實施例1相同，而固體層MS +0. 8%瓊脂粉+3%蔗糖； 液體層MS +lmg/L KT +2 mg/L 2，4_D+3%蔗糖；(5)不定芽誘導與實施例1相同，但不定芽誘導培養基MS+lmg/LKT +0. 2mg/L IBA ；(6)單倍體植株獲得與實施例1相同(7)再生植株倍性鑒定與實施例1相同。但國外進口雜交一代洋桔梗對照植株為神話 (紫邊)。
權利要求
1.一種洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法，其特征在于按以下步驟進行 (1)確定材料選取具有綜合優良性狀的雜交一代洋桔梗品種作為材料； (2)花蕾選取，預處理，消毒在開花初期，通過熒光染色法在顯微鏡下選取處于單核靠邊期的花蕾，放入塑料袋中置于4°C冰箱I 3天，清洗花蕾表面，用酒精消毒，再用升汞消毒，最后用無菌水沖洗后，晾干； (3)游離小孢子分離將消毒后花蕾放入含有B5培養基的研缽中研磨，混合液經400目雙層漏斗過濾，收集濾液于離心管中，1000rpm離心，棄去上清，再加入5 8 mL B5培養基，1000rpm離心，清洗沉淀，重復2次，離心完畢后，加入MS液體培養基于離心管中，統計細胞密度，并調整密度為1. 0X 104 1. 0 X 105個/mL，獲得游離小孢子； (4)小孢子愈傷組織誘導移取ImL含有上述小孢子的液體培養基于誘導愈傷組織的MS固液雙層培養基中，溫度為22 27°C進行黑暗培養；30 40天后，形成愈傷組織；所述MS固液雙層培養基為固體層MS +0. 8%瓊脂粉+3%蔗糖，液體層MS +0.1 4 mg/L KT+0.1 4 mg/L 2，4-D+3%鹿糖，滅菌； (5)不定芽誘導取上述愈傷組織接種于不定芽誘導培養基MS+0.1 4 mg/L KT+0.1 0. 5 mg/L IBA，光照強度為2000Lx，光照時間為8 13小時/天，溫度為22 27°C進行培養；30 40天后可見愈傷組織上綠色球型小突起，50 60天后可見萌動的不定芽或叢生小苗； (6)單倍體植株獲得取上述不定芽或小苗轉入培養基:MS+1 mg/L 6-BA+O.1 mg/LNAA，光照強度為2000Lx，光照時間為8 13小時/天，溫度為22 27°C進行培養；20 30天形成完整單倍體植株； (7)再生植株倍性鑒定將上述完整植株的根尖放入濃度為0. 002mol/L的8-羥基喹啉中1天；用移液器移出8-羥基喹啉，再用蒸餾水沖洗根尖；將沖洗好的根尖放入到卡諾氏20 24小時，取出卡諾氏，用蒸餾水沖洗根尖，將根尖放入濃度為lmol/L的HCl中5 20min，用蒸餾水沖洗干凈，用卡寶品紅染色壓片；顯微鏡觀察，確定獲得染色體數目2η =36的單倍體植株。
2.根據權利要求1所述的洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法，其特征在于步驟(3)所述Β5培養基經過裝有兩層微孔濾膜的塑料器過濾滅菌。
3.根據權利要求1所述的洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法，其特征在于步驟(3)所述MS的液體培養基為MS +3%蔗糖，并經121°C高壓滅菌20分鐘。
4.根據權利要求1所述的洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法，其特征在于(4)步驟所述的固體層和液體層分別經121°C高壓滅菌20分鐘。
全文摘要
本發明是一種洋桔梗小孢子誘導獲得單倍體植株的方法。包括以下步驟(1)確定材料；(2)花蕾選取預處理；(3)游離小孢子分離；(4)小孢子愈傷組織誘導；(5)不定芽誘導；(6)單倍體植株獲得；(7)再生植株倍性鑒定確定獲得單倍體植株。通過本發明的方法可避免花藥培養帶來的二倍體再生植株的干擾，可獲得大量單性胚狀體，單倍體植株比率可達到100%，形成足夠大的選擇群體，經秋水仙堿處理后可成為純合自交系。洋桔梗純合自交系的獲得為洋桔梗品種改良和新品種選育提供有力手段，用于雜交種組配可快速篩選出優良的雜交一代(F1)，為解決我國洋桔梗種子生產問題，具有巨大的潛在商業價值。
文檔編號A01H4/00GK103026969SQ20131001066
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月12日 優先權日2013年1月12日
發明者和鳳美, 朱永平, 王小巧, 趙興富 申請人:云南農業大學