專利名稱：煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構建及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物病毒基因工程領域，具體地，本發明涉及馬鈴薯Y病毒屬的煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)HN39分離物侵染性克隆的構建方法及應用。
背景技術：
植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病機理的重要工具。獲得了侵染性cDNA克隆后，可利用反向遺傳學方法分析病毒基因在侵染和致病等過程中的作用，進而可以獲得弱毒株系用來保護植物免受強毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造為表達載體，用來生產抗病毒蛋白、醫用獸用疫苗和抗體。利用病毒載體表達外源蛋白在植物體內表達具有產量高、費用低、無動物病原菌污染的優點，具有重要的應用價值。目前，抗齲齒抗體、新城疫病毒疫苗及葡糖腦苷脂酶等已經利用植物病毒載體成功表達。植物病毒載體一般用17啟動子或CaMV35S啟動子。17啟動子非常小，可以設計到引物上，但需要在體外轉錄成RNA后再接種。基于CaMV35S啟動子構建的侵染性克隆主要有以下優點1.無需體外轉錄；2.侵染性cDNA克隆易于制備，可直接摩擦接種，也可用基因槍或者農桿菌共浸潤的方法接種；3.侵染性cDNA克隆在體外穩定，便于保存。煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬，主要侵染煙草等茄科作物。目前TVBMV在山東、安徽、河南、云南等地的發生呈現上升趨勢。TVBMV在田間主要由蚜蟲以非持久方式傳播，并且TVBMV和馬鈴薯X病毒(PVX)有協生作用，一旦復合侵染會引起嚴重癥狀，導致更大損失
發明內容
本發明提供了一種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構建及應用，通過基因插入重組的方式，將煙草脈帶花葉病毒HN39分離物的基因組克隆到35S啟動子下游，獲得了具有強侵染力的侵染性克隆pCamTVBMV，為研究煙草脈帶花葉病毒TVBMV的基因功能奠定了基礎。利用侵染性克隆pCamTVBMV可以構建植物表達載體，在煙草、馬鈴薯等茄科植物體內穩定、高效表達抗病毒蛋白、病毒疫苗或抗體；利用侵染性克隆pCamTVBMV還可以研制弱毒株系，用來保護植株免受強毒株系的侵染。本發明實施的具體技術方案是煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構建，具體步驟如下a.煙草脈帶花葉病毒病毒粒子的提取；可采用常規提取方法獲得；b.從病毒粒子中提取病毒RNA，設計引物分三段對煙草脈帶花葉病毒基因組進行PCR擴增。利用Overlap-PCR方法分別將35S啟動子融合到煙草脈帶花葉病毒的5'末端。C.用限制性酶切的方法將全長cDNA克隆連接到pCambia0390載體，獲得pCamTVBMV ；d.將c中構建的載體通過農桿菌浸潤接種寄主植物；
e.觀察癥狀及ELISA檢測。上述的方法綜合而言，主要提供了構建煙草脈帶花葉病毒HN39的侵染性cDNA克隆，該克隆能系統侵染寄主植物。同時提供一種可以在植物體內表達外源蛋白的表達載體，它以煙草脈帶花葉病毒基因組為外源蛋白的表達載體，通過構建含有外源蛋白基因的重組cDNA，接種植物表達外源基因。采用本發明所述的技術方案，可以獲得如下的技術效果I)煙草脈帶花葉病毒不侵染動物和人，對環境安全。2)本發明采用35S啟動子，無需體外轉錄，克服了 RNA酶對體外轉錄物降解的影響。3)該侵染性克隆可穩定保存，可用農桿菌浸潤接種。保藏信息保藏時間2012年I月10日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 CGMCC保藏編號CGMCCNO. 5710
保藏單位地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號分類命名大腸埃希氏菌
圖1為TVBMV基因組片段擴增示意圖；圖2為TVBMV表達載體pCamTVBMV基因組結構示意圖；圖3為TVBMV病毒粒子(wtTVBMV)和侵染性克隆pCamTVBMV接種后第8天在寄主植物上的癥狀；圖4為pCamTVBMV-GFP接種后第14天本氏煙的癥狀，其中A為在可見光下觀察到的本氏煙表現；B為在紫外光下可以觀察到綠色熒光蛋白在本氏煙葉片中得到高效表達；圖5為挑戰接種10天后，不同弱毒株系對煙草植株的保護效果，用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保護接種3天、5和10天后用強毒株系進行挑戰接種，癥狀越重，熒光越強，在用弱毒株系處理的植株中，熒光越弱，說明交叉保護效果越好；圖6用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保護接種3天、5和10天后用強毒株系進行挑戰接種，挑戰接種5天后，不同處理的煙草植株內TVBMV病毒的濃度；
具體實施例方式以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容做進ー步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。本發明所提供的實施例，均按照常規實驗條件，其中所采用的引物序列如下表
權利要求
1.一種煙草脈帶花葉病毒的侵染性克隆，其序列如Seq ID No: 14所示。
2.根據權利要求1所述的載體，其特征在于可通過以下步驟獲得 (1)煙草脈帶花葉病毒病毒粒子的提取，可采用常規提取方法進行； (2)從病毒粒子中提取病毒RNA，設計引物分三段對煙草脈帶花葉病毒基因組進行PCR擴增。利用Overlap-PCR方法分別將35S啟動子融合到煙草脈帶花葉病毒的5'末端； (3)用限制性酶切的方法將全長cDNA克隆連接到pCambia0390載體，獲得pCamTVBMV。
3.如權利要求1所述載體在表達外源蛋白方面的應用。
4.如權利要求1所述載體在保護植物免受病毒強毒株系侵染方面的應用。
全文摘要
本發明涉及植物病毒基因工程領域，提供了一種煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構建及應用。通過基因重組的方式，將煙草脈帶花葉病毒HN39分離物的基因組克隆到35S啟動子下游，獲得了具有強侵染力的侵染性克隆。利用該侵染性克隆可以構建植物表達載體，在寄主植物體內穩定、高效表達外源蛋白，也可以將侵染性克隆改造為弱毒株系，以保護植株免受強毒株系的侵染。
文檔編號A01H5/00GK103031325SQ20131000934
公開日2013年4月10日 申請日期2013年1月10日 優先權日2013年1月10日
發明者李向東, 高瑞, 田延平, 劉煥庭 申請人:山東農業大學