專利名稱：鹽屋鏈霉菌代謝產物在防治黃瓜枯萎病菌中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及生防內生放線菌一鹽屋鏈霉菌(Stretomyces sioyaensis)的培養及其代謝產物的應用。
背景技術：
植物體內都存在大量的內生菌，內生菌最早發現于牧草，后來又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發現。迄今的研究表明，植物內生菌可增強宿主的抗病性、提高植物的生產力、抗逆抗蟲等。發揮這些作用是由于內生菌在植物體內繁殖和生長，并在體內產生有生物活性的次生代謝產物。因此，內生菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態農業和生物農藥研制方面具有重要的用途。近年來植物內生菌已引起了微生物學家、生態學家、植物保護學家的廣泛興趣，逐漸成為國內外研究的熱點。目前微生物源農藥的研究和開發在我國十分活躍，但微生物資源及其應用潛力尚沒有得到充分的發揮，而植物內生菌即是這樣一類有待開發的新興微生物資源。目前對植物病害的防治，主要采用化學農藥殺滅病原菌，但化學農藥對人畜的毒副作用和殘留問題至今仍難以有效的解決。利用內生菌產生的抗病原真菌的活性物質進行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產和低毒等優點。本發明從枸骨中分離到一株生防內生放線菌，并對該菌株發酵代謝產物進行了抑菌作用研究。該發明為微生物源農藥的進一步研制和開發提供優良的出發菌株。
發明內容
本發明的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一株
從枸骨中分離篩選出的內生放線菌-鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis);本發明
的另一目的是提供利用該菌株代謝產物防治植物真菌病害的方法。本發明鹽屋鏈霉菌的分離、篩選與鑒定:是于2012年7月在浙江杭州采集的枸骨莖中，經分離、純化、培養、發酵和活性測定等步驟獲得并保存；經微生物分類學鑒定為鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis),定名為鹽屋鏈霉菌107。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC N0.6984。鹽屋鏈霉菌107，顯微形態特征:孢子絲直、螺旋形，孢子長圓或橢圓形。本發明所述的鹽屋鏈霉菌107，經發酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產物。本發明目的通過以下技術方案來實現: 一種防治水稻紋枯病、黃瓜立枯病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病或西瓜枯萎病等植物真菌病害微生物代謝產物的制備方法，按以下步驟進行:(I)菌種的活化培養:將分離保存的鹽屋鏈霉菌107菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面平板上，在28°C ±1°C條件下培養至試管斜面長滿孢子，供接種用；
(2)發酵培養:發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，蛋白胨 5g，(NH4)2SO4 5g, CaCO3 5g, MgSO4 10g，每 300mL 三角瓶裝發酵培養液 60mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取一鉬金環鹽屋鏈霉菌107孢子接種，在28°C 土 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養128h ；(3)發酵物提取:發酵完畢，離心收集發酵上清液，用常規有機溶劑萃取經真空濃縮后獲得浸膏，用于抑菌活性測定。本發明的有益效果:一是本發明從植物枸骨莖中分離篩選出代謝物對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的鹽屋鏈霉菌107，這為農業上防治植物真菌病害病原菌提供了一株微生物菌株；二是本發明提供了利用鹽屋鏈霉菌107發酵獲得活性代謝產物的方法；該代謝產物可應用于植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
具體實施例方式實施例1:(鹽屋鏈霉菌107的分離與篩選)本發明于2012年7月在浙江杭州采集枸骨莖，經表面消毒、內生菌分離、培養、發酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的篩選等步驟，從中獲得鹽屋鏈霉菌107，保存。鹽屋鏈霉菌107抑菌活性測定:取經0.22 μ m膜過濾的發酵上清液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻，冷卻后在每個培養基平面分別放I個直徑為4mm的水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebri umOwen)或黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或西瓜枯萎病菌(F.0xysporum f.sp.niveum)或番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea)等供試菌菌餅，菌餅接于培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養72h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:
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對照菌落直徑-4測定結果表明:鹽屋鏈霉菌107代謝產物對水稻紋枯病菌、黃瓜立枯病菌、番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制率分別為91.5%,88.5%,82.5%,86.4和86.1%。實施例2:(鹽屋鏈霉菌107發酵代謝產物的制備方法)按以下步驟進行:(I)菌種的活化培養:將分離保存的鹽屋鏈霉菌107菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28°C ±1°C條件下培養至試管斜面長滿孢子，供接種用；(2)發酵培養:發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，蛋白胨 5g，(NH4)2SO4 5g, CaCO3 5g, MgSO4 10g，每 300mL 三角瓶裝發酵培養液 60mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取一鉬金環鹽屋鏈霉菌107孢子接種，在28°C 土 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養128h ；
(3)發酵物提取:發酵完畢后離心收集發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物，供抑菌活性測定。以下實施例3、4中所述的鹽屋鏈霉菌107代謝產物均為實施例2所制產品；所述產品的百分含量均為質量/體積百分比。實施例3:(鹽屋鏈霉菌107代謝產物對水稻紋枯病菌、黃瓜立枯病菌、番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制作用)(I)準確稱取鹽屋鏈霉菌107代謝產物0.20g,并加入IOmL體積的無菌水，超聲波震蕩充分溶解，最終配置成濃度為20g/L的母液；(2)抑菌活性測定:取上述母液分別稀釋成濃度為2g/L和lg/L的溶液，取各濃度溶液ImL于無菌培養皿內，與9mL冷卻至50°C的PDA培養基迅速混勻(鹽屋鏈霉菌107代謝產物終濃度為200mg/L和100mg/L)，冷卻后在每個培養基平面分別放I個直徑為4mm的水稻紋枯病菌或黃瓜立枯病菌或番茄灰霉病菌或黃瓜枯萎病菌或西瓜枯萎病菌的菌餅，菌餅接于培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28°C培養36h，以常規化學藥劑和無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率:
權利要求
1.鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis) 107代謝產物防治黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)的應用，所述的鹽屋鏈霉菌107在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC N0.6984，所述代謝產物按以下方法制備: (1)菌種的活化培養:將分離保存的鹽屋鏈霉菌107菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面平板上，在28°C ±1°C條件下培養至試管斜面長滿孢子，供接種用； (2)發酵培養:發酵培養液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，蛋白胨5g，(NH4)2SO4 5g，CaCO3 5g，MgSO4 10g，每300mL三角瓶裝發酵培養液60mL ;配制后`121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取一鉬金環鹽屋鏈霉菌107孢子接種，在`28 0C 土 1°C條件下，搖床轉速180轉/分鐘，發酵培養128h ； (3)發酵物提取:發酵完畢后離心收集發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇 萃取， 取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物。
全文摘要
本發明涉及微生物技術領域，本發明所述的枸骨內生菌是從浙江杭州采集的枸骨植物活體中采用內生菌微生物分離技術分離獲得的，經微生物分類學鑒定為鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis)，定名為鹽屋鏈霉菌107。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號CGMCC No.6984。本發明最顯著的特征是該菌株液體發酵能夠產生對植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等有抑制作用的活性代謝產物，是農業上重要的微生物資源。
文檔編號A01N63/02GK103222484SQ201310008090
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月7日 優先權日2013年1月7日
發明者申屠旭萍, 俞曉平, 湯谷, 劉葉丹, 陳昳麗, 俞葉微, 曾惠娟 申請人:中國計量學院