專利名稱：東亞對開蕨種質試管保存及遷地保護方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體地說是瀕危珍稀植物東亞對開蕨種質保存方法和遷地繁育保護方法。
背景技術：
東亞對開蕨iPhyllitis japonica Kom.)也稱東北對開蕨、日本對開蕨、對開蕨。既具有觀賞價值，又有藥用價值。屬鐵蕨科，多年生常綠草本植物。根狀莖短，橫臥或斜生，根細長，多橫走。世界稀有物種，我國僅一屬一種，國家二級珍稀瀕危保護植物。產于長白山南麓和西側局部地區，主要分布于吉林省長白朝鮮族自治縣、臨江、集安、撫松等的一些狹窄區域，并且分布星散。對開蕨喜空氣濕度大、避風陰濕、腐殖土豐厚且多有坡度的森林土壤環境，東亞對開蕨自然貯量極少。這些地區現沒有劃入長白山自然保護區保護范圍，目前尚無明確的保護措施。有研究表明對開蕨在長白山區為衰退種，近年來隨著森林生態環境逐年惡化，其長勢日益不良，數量逐減，有的分布區域已絕跡。因此，為保護這一珍稀瀕危植物資源，防止自然和人為因素對其造成毀滅性破壞，迫切需要人工對其繁殖和保護。人工繁殖需要大量的種質，而東亞對開蕨自然貯量稀少，大量采集野生種質，這種行為的本身就會給本來就脆弱生態環境造成傷害，以至于傷害大于保護的后果。人工長期傳代培養也會造成品種退化，不適合野生環境下生長繁殖。
發明內容
本發明的目的是為了保護瀕危珍稀植物東亞對開蕨，擴大野生種群的面積，而提供一種東亞對開蕨種質保存方法和遷地保護方法。一種東亞對開蕨種質保存方法，它包括將原葉體接種于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培養基中，置于光照培養箱內，光照強度200-3001x ;光照5_7h/d，溫度為14-16°C ；
所述的培養基為1/2MS+蔗糖30/L ；
所述溫度為15°C ；
所述的培養基為固體培養基，每12個月更換一次。東亞對開蕨遷地保護方法，它包括
1)采集東亞對開蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，將剝出的孢子囊放在經滅菌后的濾紙上，小心壓碎孢子囊，散出其內的孢子，連同濾紙片一同接種于MS+蔗糖20g/L、培養基中；100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，孢子萌發為原葉體團；
2)將原葉體團切成小塊接種于1/2MS -MS (全)+蔗糖培養基中繼代與增殖；
3)將部分原葉體按上述的東亞對開蕨種質保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭為基質 的花盆中，溫室培養30天，噴施O. 1% KH2PO4孢子體誘導，當幼苗成長至4片葉以上，每年六月下旬遷地移栽；
4)每12個月轉接一次，每次轉接時將一部分原葉體繼續保存培養，其余進行增殖繼代、試管外以草炭為基質誘導孢子體植株形成、遷地移栽。本發明提供了一種東亞對開蕨種質保存方法，將原葉體接種于1/4 MS MS (全)+蔗糖25-30g/L培養基中，置于光照培養箱內，光照強度200-3001x ;光照5_7h/d，溫度為14-16°C ；12個月后，幾乎沒有生長和增殖，狀態與起初培養時相似，將其轉入繼代培養條件下后，仍能正常增殖與生長；培養60天后，增值率為4. 5左右，孢子體也可以正常形成；已進行了 5年的保存處理；本發明還提供了東亞對開蕨遷地保護方法，將保存的原葉體每年繼代繁殖，試管外以草炭為基質誘導孢子體植株形成、遷地移栽；在長白山區選取了與對開蕨原生境基本相似的3個地點作為遷地移栽供試區；每個地點栽植100株；經生長4年，長
勢良好，真正達到對瀕危植物的保護。
圖1沒破碎的孢子葉孢子120d生長狀態；
圖2破碎孢子囊后的孢子60d培養；
圖3液體培養40d原葉體生長狀態；
圖4液體培養70d原葉體生長狀態；
圖5固體培養孢子120d生長狀況；
圖6接種時原葉體；
圖7 60d培養后的原葉體；
圖8栽植120d后的孢子體狀況；
圖9分株后的孢子體植株；
圖10對開蕨組培苗溫室馴化；
圖11臨江市洋魚頭村生長狀況；
圖12敦化市馬五店山區2年栽植生長狀況；
圖13野外3年栽植生長狀況。
具體實施例方式實施例1 孢子萌發
材料來自吉林省白山市林區；取東亞對開蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，實驗室中將孢子葉切成Icm大小；無菌條件下O. l%HgCl2溶液滅菌5分鐘，無菌水沖洗6次，濾紙吸干后接種。接種方法接種分三種方式，一是孢子葉直接接種；二是在超凈工作臺解剖鏡下將孢子葉中的孢子囊剝離出后接種；三是解剖鏡下將剝出的孢子囊放在經滅菌后2cmX2cm大小的濾紙上，用手術刀小心壓碎孢子囊，散出其內的孢子，連同小濾紙片一同接種。孢子培養采用1/2MS+蔗糖20g的固體培養和液體培養兩種方法。培養條件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天溫度25_26°C，晚間20_22°C。孢子葉和孢子囊在固體培養基中大約IOOd左右的培養孢子開始萌發，120d時達到肉眼可見的程度(見圖1，圖5 )，而破碎孢子囊后的孢子經50-60d的培養即達肉眼可見狀態，而且萌發后的長勢也明顯好于前兩種(見圖2);可見，東亞對開蕨離體培養中去除孢子囊殼的孢子更利于其萌發。將孢子葉中的孢子囊剝離出后分別進行液體和固體培養。結果發現液體培養基中的孢子經30d培養后開始萌發，約40d出現明顯可見的原葉體，其大小可達O. 3cm-0. 5cm(見圖3);原葉體再經30d培養后，可形成大量的原葉體團，大小達1. 5-2. Ocm左右(見圖4);而此時固體培養的孢子剛處于萌發狀態(圖5);液體培養中的孢子萌發和原葉體生長速度遠遠好于固體培養；這說明液體培養較固體培養更適合東亞對開蕨孢子萌發和原葉體的生長。實施例2原葉體繼代與增殖
將孢子萌發后形成的原葉體團分切成約O. 5cm大小的小塊，每小塊約含原葉體5 - 10片，分別接種到含有不同濃度植物生長調節劑的固體MS培養基中(見表1)，每瓶接種8 -10塊。將孢子萌發后形成的原葉體團分別接種到含有不同濃度植物生長調節劑的MS培養基中，培養條件100-2001x散射光下，光照12h/d。白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，與孢子萌發條件相同；60d后觀察原葉體增殖及生長情況(見表1，圖6，圖7)。原葉體在供試的幾種培養基中均能以約5倍速率增殖。新復極差測驗表明，各培養基中的原葉體增殖率無顯著差異。但是，原葉體的生長狀態卻明顯不同，在無植物生長調節劑和KT為O. 2mg/l以下的培養基中，原葉體總體狀態表現為生長平展，較寬大。隨著生長調節劑的濃度增高，原葉體總體狀態表現為狹窄、葉片不展開、密實，且生長狀態不佳，這一類原葉體很難用于進一步增殖和孢子體植株的誘導。由此可見，原葉體增殖應以無植物生長調節劑或少量KT的培養基為好。
權利要求
1.一種東亞對開蕨種質保存方法，它包括將原葉體接種于1/4 MS MS+蔗糖25-30g/L培養基中，置于光照培養箱內，光照強度200-3001x ；光照5_7h/d，溫度為 14-16°Co
2.根據權利要求1所述的一種東亞對開蕨種質保存方法，其特征在于所述的培養基為 1/2MS+ 蔗糖 30/L。
3.根據權利要求1或2所述的一種東亞對開蕨種質保存方法，其特征在于所述溫度為 15。。。
4.根據權利要求3所述的一種東亞對開蕨種質保存方法，其特征在于所述的培養基為固體培養基，每12個月更換一次。
5.東亞對開蕨遷地保護方法，它包括1)采集東亞對開蕨含有成熟孢子囊的孢子葉，將剝出的孢子囊放在經滅菌后的濾紙上，小心壓碎孢子囊，散出其內的孢子，連同濾紙片一同接種于MS+蔗糖20g/L的培養基中； 100-2001x散射光下，光照12h/d ;白天溫度25-26°C，晚間20_22°C，孢子萌發為原葉體團；2)將原葉體團切成小塊接種于1/2MS MS+蔗糖培養基中繼代與增殖；3)將部分原葉體按權利要求1所述的東亞對開蕨種質保存方法保存；其余出瓶移栽以草炭為基質的花盆中，溫室培養30天，噴施O. 1% KH2PO4孢子體誘導，當幼苗成長至4片葉以上，每年六月下旬遷地移栽；4)每12個月轉接一次，每次轉接時將一部分原葉體繼續保存培養，其余進行增殖繼代、試管外以草炭為基質誘導孢子體植株形成、遷地移栽。
全文摘要
本發明提供了一種東亞對開蕨種質保存方法，將原葉體接種于1/4～MS(全)+蔗糖25-30g/L培養基中，置于光照培養箱內，光照強度200-300lx；光照5-7h/d，溫度為14-16℃；12個月后，幾乎沒有生長和增殖，狀態與起初培養時相似，將其轉入繼代培養條件下后，仍能正常增殖與生長；已進行了5年的保存處理；本發明還提供了東亞對開蕨遷地保護方法，將保存的原葉體每年繼代繁殖，試管外以草炭為基質誘導孢子體植株形成、遷地移栽；在長白山區選取了與對開蕨原生境基本相似的3個地點作為遷地移栽供試區；每個地點栽植100株；經生長4年，長勢良好，真正達到對瀕危植物的保護。
文檔編號A01H4/00GK103004606SQ20121058864
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者趙春莉, 趙和祥, 顧德峰, 李金英, 黃翔童, 陳麗飛, 董然, 劉曉嘉, 劉淑英, 姜立新 申請人:吉林農業大學