專利名稱：一種檢測石榴枯萎病菌致病蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，具體涉及一種在芋頭葉片上檢測石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性的方法，屬于植物保護領域。
背景技術：
石榴枯萎病為最近幾年在中國云南和四川省石榴種植發生的新病害，已經造成大量的經濟損失，這種病害為甘薯長_殼菌(Ceratocystis fimbriata)引起(Huang等， 2003)。2004年在云南省蒙自縣石榴枯萎病造成的經濟損失達1500萬元以上，其中部分重病區病株率高達29. 2%，特別是掛果石榴樹的大面積死亡，造成石榴產業的毀滅性損失(鄧吉等，2005)。在石榴枯萎病菌致病性的研究中，通常用石榴枯萎病菌的孢子在石榴植株莖干上進行傷口接種并觀察產生癥狀的方法來確定其致病性，接種后產生的病斑大小為鑒定不同石榴枯萎病菌菌株致病力差異檢測的主要手段。已有報道表明來自中國石榴枯萎病菌和芋頭黑腐病菌的C. fimbriata對中國石榴寄主植物和芋頭寄主植物具有一樣的強致病性，這表明它們之間可以互相侵染對方的寄主植物，沒有表現出寄主專化性(Huang等， 2008;余磊，2010)。并且它們在分別接種芋頭植株后，生理生化水平上的反應也具有一致性(余磊等，2011; 2011)。近年來的研究表明，病原菌產生的蛋白與寄主抗性基因蛋白產物的分子互作是病原菌與寄主互作機制的核心。與孢子接種的目的類似，這些蛋白的功能也要通過在寄主植物上接種后觀察致病的癥狀來進行檢測。目前實驗中石榴枯萎病菌致病分泌蛋白主要來源于其菌絲體產生的蛋白，且對石榴枯萎病菌進行液體培養是獲得致病分泌蛋白的主要方法。還未見到專門用于石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性檢測方法的文獻和專利報道。因石榴為木本植物，對其莖干進行傷口接種存在致病性反應周期較長、癥狀不易觀察等局限。這導致了無法像石榴枯萎病孢子接種那樣通過測量病斑長度，來對石榴枯萎病菌產生的不同致病性分泌蛋白的致病力差異進行定量分析 ，限制了對石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病機制的研究。
經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。
參考文獻
Huang Q, Zhu Y Y, Chen H R, Wang Y Y, Liu YL, Lu W J, Ruan X Y. 2003.First Report of Pomegranate Wilt Caused by Ceratocystis fimbriata in Yunnan, China[J]. Plant Disease, 87，1150.
Huang Q，Wang Y Y，Zhao Y Y，Jiao Y X，Li X F，Chen H R，and Zhu Y Y. 2008. First report of taro black rot caused by Ceratocystis fimbriata in China[J]. Plant Pathology, 57: 780.
鄧吉，陸進，李健強，潘俊，朱春雨，吳新平.2005.石榴枯萎病病害分級標準研究[J].中國農業科學，38(12): 2440-2445.
余磊.2010.云南農業大學.三種寄主的甘薯長喙殼病菌研究[博士論文].
余磊，高玲玲，郭建偉，陳小龍，李秀芬，劉芬，黃瓊，陳海如.2011.甘薯長喙殼侵染對甘薯塊根抗氧化酶活性影響.中國生態農業學報.19(1): 141-145.
余磊，陳小龍，郭建偉，高玲玲，李秀芬，劉芬，黃瓊，陳海如.2011.不同寄主甘薯長_殼菌侵染對芋頭抗氧化酶活性影響.華中農業大學學報.30(1):61-65.
發明內容
本發明的目的在于提供一種在芋頭葉片上檢測石榴枯萎病菌致病蛋白的方法。
本發明的目的是這樣實現的
(I)芋頭生長至第3片時，選擇完全展開的健康葉片進行接種；
(2)選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設備分別等距形成直徑2 mm的壓傷斑3個，在致傷處接種致病分泌蛋白，該致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方為蔗糖20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液體培養基中培養72小時后獲得，蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I ;
(3)接種后96小時在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形或圓形，測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值；
(4)將石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑長度值劃分的標準進行致病性弱、中等和強的分類；其分類標準為病斑長度為3. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長度大于5.1mm為強致病性。
本發明優點在于解決了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性檢測的問題。能夠在芋頭葉片上形成規則的接種點而對其組織沒有明顯的傷害，接種石榴枯萎病菌的致病分泌蛋白后形成的病斑與孢子接種的癥狀一致，沿葉脈方向延伸的病斑長度即作為不同致病分泌蛋白致病力大小比較的依據。具體實施方案
實施例一
芋頭生長至第3片葉完全展開時接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個，將培養后的石榴枯萎病菌轉入到蔗糖液體培養基中，進行培養后得到弱致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形， 測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值。按照病斑長度為2. 5_至 4mm之間為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長度大于5.1mm為強致病性的分類標準，對該分泌蛋白的致病性進行檢測，結果見表I。
實施例二
芋頭生長至第3片葉完全展開時接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個，將培養后的石榴枯萎病菌轉入到蔗糖液體培養基中，進行培養后得到中等致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形，測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值。按照病斑長度為2. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長度大于5.1mm 為強致病性的分類標準，對該分泌蛋白的致病性進行檢測，結果見表I。
實施例三
芋頭生長至第3片葉完全展開時接種。選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設備分別在葉片主脈兩邊近葉緣4cm處和葉尖3cm處形成直徑2mm的壓傷斑 3個，將培養后的石榴枯萎病菌轉入到蔗糖液體培養基中，進行培養后得到強致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分別在芋頭植株的葉片致傷處接種，用滅菌去離子水接種作為對照。蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I。接種后96小時在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形，測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值。按照病斑長度為2. 5_至 4mm之間為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5mm之間為中等致病性；病斑長度大于5.1mm為強致病性的分類標準，對該分泌蛋白的致病性進行檢測，結果見表I。
表I石榴枯萎病菌致病分泌蛋白在芋頭(香芋)接種后病斑的長度
權利要求
1.一種檢測石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，其特征在于該方法的具體步驟如下a.芋頭生長至第3片時，選擇完全展開的健康葉片進行接種；b.選擇在接種芋頭葉片主脈與邊緣的近中間部分，用致傷設備分別形成直徑2mm的壓傷斑3個，在致傷處接種致病分泌蛋白，該致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方為蔗糖 20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液體培養基中培養72小時后獲得，蛋白的接種濃度為50 μ g/ml，接種體積為5 μ I ;c.接種后96小時在芋頭葉片上形成的病斑為橢圓形或圓形，測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值；d.將石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑長度值劃分的標準進行致病性弱、 中等和強的分類；其分類標準為病斑長度為3. 5mm至4mm之間為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5_之間為中等致病性；病斑長度大于5.1mm為強致病性。
全文摘要
一種檢測石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，屬于植物保護領域。方法為芋頭生長至第3片時，選擇完全展開的健康葉片接種。在接種芋頭葉片的邊緣近中間部分，致傷直徑2 mm的壓傷斑3個，將石榴枯萎病菌液體培養后得到的分泌蛋白在致傷處接種，蛋白的接種濃度為50μg·ml-1，接種體積為5μl。接種后96小時在芋頭葉片上形成橢圓形或圓形的病斑，測量向葉尖和葉基方向延伸的最長值作為病斑的長度值，該值是比較不同蛋白致病力大小的依據。其分類標準為病斑長度為3.5mm至4mm為弱致病性；病斑長度在4.1mm至5mm為中等致病性；病斑長度大于5.1mm為強致病性。該方法解決了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性檢測的問題，對于研究石榴枯萎病菌致病相關分泌蛋白的功能具有重要意義。
文檔編號A01G7/06GK103026910SQ201210580190
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者余磊, 趙建榮, 徐勝光, 吳旭, 蘇源, 劉佳妮, 陳澤斌 申請人:昆明學院