專利名稱：一種甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病害生物防治領域，特別是利用有益微生物對植物病害進行生物防治，具體涉及甲基營養型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus),以及利用該菌株制備生物菌劑以及所述生物菌劑防治植物病害的應用。
背景技術：
植物病害的流行不但引起作物減產，給人類造成重大經濟損失，甚至帶來災難性后果。植物病害的危害還會導致農產品品質低劣，不堪使用或加工，甚至導致人畜中毒。在植物病害的防治中，化學農藥因為具有成本低、見效快、省時省力等優點曾一度成為人們的首選，但是，化學農藥一般不可降解，隨著化學農藥的大量使用，引發了環境污染、生態破壞、食品污染等事件。這使研究開發利用生物農藥成為植物保護工作者的重要研究課題。生物農藥是指利用生物活體或其代謝產物針對農業有害生物進行殺滅或抑制的制劑，具有安全、高效、無污染等特點，與保護生態環境和社會協調發展的要求相吻合，是未來農藥發展的必然趨勢。微生物農藥是生物農藥中應用最為廣泛的一類，也是生物防治的重要材料。微生物源農藥的主要成分是微生物活體及其次生代謝產物，由于微生物種類多樣，其活性也很廣泛，包括殺蟲、殺菌、除草以及植物生長調節作用等。自然界中用于生防細菌的，主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬。特別是 近幾年，利用微生物防治植物真菌性病害由于對環境安全，可以減緩病原菌產生抗藥性，已經成為當前防治植物病害的主流方法。甲基營養型芽孢桿菌是一種嗜溫、好氧、產芽孢的桿狀細菌，其生理特征多樣，該菌在自然界中廣泛存在，具有獨特的一碳代謝途徑，能夠將自然界中取之不盡的一碳化合物如甲醇、甲醛等轉變為菌體自身所需的營養物質，同時又會產生多種有益的代謝副產物L.絲氨酸、維生素B12、聚P羥基丁酸鹽等。對人畜無毒無害，不污染環境，具備生命力強，繁殖快速能產生多種抗菌素和酶，具有抗菌活性和極強的抗高溫、抗強酸強堿能力。甲基營養型芽孢桿菌不僅可以在土壤、植物根際體表等外界環境中廣泛存在，而且是植物體內常見內生細菌，尤其是在植物的根、莖內部。甲基營養型芽孢桿菌通過成功定殖于煙草、水稻等植物根際、體表或體內，改變其周圍菌群環境和種類，與病原菌競爭植物周圍的位點，并且分泌多種抗菌物質以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統抵御病原菌入侵，從而達到改良土壤和生防的目的，具有防病和促生作用。煙草青枯病是一種由青枯勞爾氏菌(Ralatonia solanacearum)引起的、以土壤傳播為主的、毀滅性的細菌性病害。此病是熱帶、亞熱帶地區煙草的主要病害之一，在我國長江流域及其以南煙區普遍發生，其中以廣東、福建、湖南、四川及貴州煙區危害較重。目前，在生產中主要采用化學農藥防治，但是無法有效防止該病發生，而且長期大量施用化學農藥既容易使病菌產生抗藥性，又容易造成嚴重的環境污染。水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌黃單胞桿菌水稻變種(Xanthomonas oryzaepv.oryzae, Xoo)引起的，是水稻三大病害之一，在世界上幾乎所有的水稻種植區均有發生，我國除新疆、西藏和東北的北部以外均有不同程度的發生，長江以南和江淮平原秈稻產區是常發區，嚴重影響水稻產量，目前主要依賴化學農藥防治，但是長期使用，使病菌容易產生抗藥性，并且嚴重污染環境。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的甲基營養型芽孢桿菌。本發明的另一目的在于提供所述甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法，以及由該方法制備所得的發酵產物。本發明的另一目的在于提供甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑及其制備方法。本發明的另一目的在于提供利用所述甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑防治植物病害的用途。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種甲基營養型芽孢桿菌，其屬于芽孢桿菌屬，其命名為Bacillusmethylotrophicus ;保藏登記號為CGMCCNo. 6793,保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏單位地址北京市朝陽區大屯路；保藏時間為2012年11月07
曰。 本發明的上述甲基營養型芽孢桿菌是從煙草根際土壤分離得到的，通過菌株的分離、純化以及篩選步驟獲得的。菌株鑒定采用形態特征、生理生化實驗、分子生物學鑒定法，以及16SrDNA同源序列比對分析最終確定上述保藏編號的菌株為甲基營養型芽孢桿菌(BaciIlusmethylotrophiIus)。本發明所述甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法，所述方法包括下述步驟步驟一菌種活化將保藏登記號為CGMCCNo. 6793的甲基營養型芽孢桿菌菌種接種到LB固體培養基上面，于30°C活化培養48h，所述LB固體培養基配方為酵母浸膏3_5g，蛋白胨8-10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水1000ml,pH 7. 4 7. 6，連續轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用；步驟二 種子液的制備從LB固體培養基上挑取菌種接種到裝有LB液體培養基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中振蕩培養，即得到種子液，所述的LB液體培養基配方為酵母浸膏 3-5g，蛋白胨 8-10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7. 4 7. 6 ;培養條件30°C，48h ;步驟三發酵培養將種子液先后進行種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養，得到發酵液；其中種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養步驟分別如下種子罐發酵培養FJ液體培養基，裝料系數0. 7，培養條件35_37°C，42h，接種量6%，通氣量 '2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ；大規模工業發酵培養FJ液體培養基，裝料系數0. 7，培養條件35_37°C，60_70h，接種量6%，通氣量2. 0L/min，攪拌轉速220r/min ；其中在種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養中，種子液的接種量均占液體培養基總量的6-8% ；所述的FJ液體培養基配方為黃豆餅粉1.5%，蔗糖I %，KH2PO4 0. 05 %,MgSO4O. 02 %，NaClO.1 %，其余為水，所列百分比為重量百分比。
優選地，若在步驟三的發酵培養過程中有泡沫產生，可滴加敵消泡。進一步地，本發明提供由上述技術方案所述的甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法制備所得的發酵產物。進一步地，根據上述發酵產物，本發明還提供一種甲基營養型芽孢桿菌的生物菌齊U，所述生物菌劑是通過如下步驟制得的步驟一過濾并濃縮產物將采用上述甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法制備所得的發酵產物用草酸調節pH至6. 5-7. O后，將發酵產物通過截留分子量40000-100000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為35-37°C，膜通量為50-60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍，制得經濃縮的芽孢溶液，所述濃縮方法為使用50萬Da的分子篩膜，蠕動泵流速為4檔，通量為420ml/min，出液口壓力為O. 08MPa ；步驟二 噴霧干燥向步驟一的經濃縮的芽孢溶液中添加1. 0%的填料，隨后將芽孢溶液經噴霧制成粉末，噴霧干燥的進口溫度為170-190°C，出口溫度為65-85°C，進料速度60mL/min，噴頭壓力O. lOMPa，即得到本發明的甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑；所述填料為白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣。進一步地，本發明提供將上述甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑防治植物病害的用途；特別是用于防治煙草、白菜、 水稻、棉花作物中的病害；優選地，所述煙草病害為煙草青枯病，該病害是由煙草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)引起的；所述白菜病害為白菜腐爛病，該病害是由軟腐細菌(Erwiniacarotovora)引起的；所述水稻病害為水稻白葉枯病和水稻細菌性條斑病，所述病害均是由水稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae)引起的；所述棉花病害為棉花角斑病，所述病害是棉角斑病黃單胞菌(Xanthomonas campestrispv. malvacearum(E.F. Smith)Dowson)引起的。除非另有說明，本申請說明書中的均為重量百分比。本發明具有以下有益效果1、由本發明的甲基營養型芽孢桿菌所制得的生物菌劑，其環境相容性好，具有很高的生物活性，特別是對由煙草青枯病具有較好的防效，通過實驗證明，該甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑對煙草青枯病、白菜軟腐病、水稻白葉枯病、水稻細菌性條斑病和棉花角斑病的防效高達80%以上。2、由本發明的甲基營養型芽孢桿菌制得的生物菌劑是采用新型工藝發酵、先進超濾濃縮分離技術研發的新型高活性高濃度生物菌劑，有效活孢子數達50億/克以上。
圖1為本發明的甲基營養型芽孢桿菌的16SrDNA同源序列比對分析樹狀圖。
具體實施例方式為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例作進一步的說明。實施例1 :本申請甲基營養型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophilus)的分離與篩選(I)、芽孢桿菌的分離
稱取煙草根際土壤IOg,倒入裝有90ml滅菌水的錐形瓶中，200r/min振蕩20min,80°C水浴30min, 10倍比稀釋,涂布分離。(2)、芽孢桿菌的純化根據細菌的特征及時挑取單個細菌落至LB固體培養基上，采用劃線分離的方法純化；純化的細菌經革蘭氏染色和芽孢染色，顯示菌體呈桿狀、產芽孢、G+的分離物為芽孢桿菌；所述LB固體培養基配方為酵母浸膏5g,蛋白胨8g,NaCl 5g,瓊脂 15g，水 1000ml, pH 7. 4。(3)、拮抗芽孢桿菌的篩選用TTC培養基選擇具有活性的煙草青枯病菌作為指示菌，將煙草青枯病菌配成2X108cfu/ml濃度的菌懸液，轉接到BPA培養基上，制成青枯病菌含菌培養基。待吹干后，在平板中央接上述己分離純化的芽孢桿菌菌株，30°C培養2-3d，測定抑菌圈直徑和抑菌帶(從活性菌菌落的邊緣到抑菌圈的外緣)的大小。所述TTC培養基的配方為胰蛋白胨17. Og,大豆胨3. Og,氯化鈉2. 5g,葡萄糖6. Og,硫乙醇酸鈉O. 5g, L-胱氨酸O. 25g亞硫酸鈉O.1g瓊脂16. Og ;所述BPA培養基的配方為牛肉浸膏3-5g，蛋白胨5-10g，蔗糖10-12g，酵母浸膏l_2g，瓊脂17-20g，加水至1L。分離篩選獲得本申請的甲基營養型芽孢桿菌，實驗室編號為LW-6。實施例2 :甲基營養型芽抱桿菌(Bacillus methy lotrophi lus)的鑒定對實施例1所得的甲基營養型芽孢桿菌的鑒定過程為(I)、形態特征在NA固體培養基上LW-6菌落呈現奶白色，菌落表面粗糙，邊緣呈現鋸齒狀，透過電鏡顯示LW-6呈桿狀，革蘭氏陽性，周生鞭毛，單個細胞大小為O. 5-0. 6umX2. 0-2. 5um。所述NA固體培養基的配方為牛肉浸膏2_3g，蛋白胨5g，葡萄糖
2.5-3g，瓊脂 16-18g，加水至 1000ml。(2)、生理生化實驗通過對甲基營養型芽孢桿菌的生理生化特性試驗(如表I所示)并結合該菌株的形態特征，對照《伯杰氏細菌手冊》(Buchanan & Gibbons, 1984)和《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進行檢索，鑒定該菌株為芽孢桿菌屬。
表I本申請甲基營養型芽孢桿菌的生理生化特征
權利要求
1.一種甲基營養型芽孢桿菌，其屬于芽孢桿菌屬，其命名為 Bacillusmethylotrophicus ;保藏登記號為CGMCCNo. 6793,保藏機構為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間為2012年11月07日。
2.根據權利要求1的甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法，所述方法包括下述步驟 步驟一菌種活化將保藏登記號為CGMCCNo. 6793的甲基營養型芽孢桿菌菌種接種到LB固體培養基上面，于30°C活化培養48h，所述LB固體培養基配方為酵母浸膏3_5g，蛋白胨8-10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水1000ml,pH 7. 4 7. 6，連續轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用；步驟二 種子液的制備從LB固體培養基上挑取菌種接種到裝有LB液體培養基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養箱中振蕩培養，即得到種子液，所述的LB液體培養基配方為酵母浸膏 3-5g，蛋白胨 8-10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7. 4 7. 6 ;培養條件30°C，48h ;步驟三發酵培養將種子液先后進行種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養，得到發酵液；其中種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養步驟分別如下種子罐發酵培養FJ液體培養基，裝料系數O. 7，培養條件35-37°C，42h，接種量6%， 通氣量2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ；大規模工業發酵培養FJ液體培養基，裝料系數O. 7，培養條件35-37°C，60-70h,接種量6%，通氣量'2. OL/min，攪拌轉速220r/min ；其中在種子罐發酵培養和大規模工業發酵培養中，種子液的接種量均占液體培養基總量的6_8% ；所述的FJ液體培養基配方為:黃豆餅粉1.5%，蔗糖I%，KH2PO4 O. 05%,MgSO4O. 02%, NaClO.1 %，其余為水,所列百分比為重量百分比。
3.根據權利要求2的發酵方法，其中在步驟三的發酵培養過程中滴加敵消泡。
4.根據權利要求2至3任一所述的甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法制得的發酵產物。
5.一種甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑，所述生物菌劑是通過如下步驟制得的 步驟一過濾并濃縮產物將權利要求4的發酵產物用草酸調節pH至6. 5-7. O后，將發酵產物通過截留分子量40000-100000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為35-37°C， 膜通量為50-60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數為6-7倍， 制得經濃縮的芽孢溶液，所述濃縮方法為使用50萬Da的分子篩膜，蠕動泵流速為4檔，通量為420ml/min,出液口壓力為O. 08MPa ；步驟二 噴霧干燥向步驟一的經濃縮的芽孢溶液中添加1.0%的填料，隨后將芽孢溶液經噴霧制成粉末，噴霧干燥的進口溫度為170-190°C，出口溫度為65-85°C，進料速度 60mL/min,噴頭壓力O.1OMPa,即得到本發明的甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑；所述填料為白炭黑、微細滑石粉、輕質碳酸鈣或2500目超細重鈣。
6.根據權利要求5的甲基營養型芽孢桿菌的生物菌劑防治植物病害的用途。
7.根據權利要求6的用途，所述植物病害是煙草、白菜、水稻、棉花作物中的病害。
8.根據權利要求6的用途，所述植物病害是煙草青枯病，白菜腐爛病,水稻白葉枯病、 水稻細菌性條斑病或棉花角斑病。
全文摘要
本發明涉及一種新的保藏登記號為CGMCCNo.6793的甲基營養型芽孢桿菌，該菌株是從煙草根際土壤分離得到的，通過菌株的分離、純化以及篩選步驟獲得的。本發明進一步提供所述甲基營養型芽孢桿菌的發酵方法、由該方法制備所得的發酵產物，以及基于該發酵產物的生物菌劑及其制備方法，進一步地還提供所述生物菌劑防治多種植物病害的用途。該生物菌劑環境相容性好，有效活孢子數達50億/克以上，具有很高的生物活性，特別是對由煙草青枯病具有較好的防效，其對煙草青枯病、白菜軟腐病、水稻白葉枯病、水稻細菌性條斑病和棉花角斑病的防效高達80％以上。
文檔編號A01P1/00GK103045515SQ201210579899
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者唐滿倉, 翟楓, 馬玉明, 安德榮 申請人:陜西恒田化工有限公司