專利名稱：一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法
技術領域：
本發明屬于魚類細胞工程育種技術領域，特別涉及一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法。
背景技術：
雌核發育是單性生殖的一種，是指卵子只依靠本身的遺傳物質發育成為個體的生殖行為。在魚類提純育種中，一般認為I代雌核發育魚的純合效應相當于多代魚的自交提純的效應，因此在雌核發育后代中可獲得遺傳純度高、抗逆性強、生長速度快等優勢個體。人工雌核發育技術作為一種細胞工程技術，在魚類提純育種、探討魚類性別決定機制、快速建立純系和魚類單性養殖方面具有重要理論意義和廣闊的應用前景。錦鯉(CyprinuscarpioL.)隸屬于鯉形目、鯉科、鯉屬，是一種大型名貴觀賞魚類， 被人們稱為“水中活寶石”、“會游泳的藝術品”。根據斑紋的顏色可分為三大類，即單色類，如淺黃、黃金、變種鯉等；雙色如紅白、寫、別甲等；三色類如大正三色、昭和三色、衣等。該魚是由鯉魚突變品系經人工雜交選育而成，基因高度混雜，遺傳性狀極不穩定，在養殖過程中主要是以色斑這一表型特征進行挑選，而市場上主要以其花色、斑紋等為主要觀賞價值，但目前對于錦鯉的色素遺傳機制尚不清楚。經驗豐富的育種者即使很仔細地進行錦鯉品系間的交配，仍很難預測其子代的色斑分化，只有通過無數次繁育，十數次挑選，方能從數以萬計的苗種中挑選出幾條極具觀賞價值的個體，這也是目前錦鯉價格隨其觀賞價值的增長而成指數比例增長的原因。因此，通過人工雌核發育技術獲得基因高度純合的后代，構建一系列具有觀賞價值的錦鯉純系，使育種者能有效地預測和控制花色，為定向培育優良錦鯉新品種奠定基礎，對進一步探討錦鯉色素遺傳機制提供研究樣本，具有重要的理論意義和實際應用價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法。利用本發明技術可快速獲得錦鯉純系，為定向培育優良錦鯉新品種奠定基礎，對進一步探討錦鯉色素遺傳機制提供研究樣本。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，包括以下步驟首先挑選雌性錦鯉和雄性團頭魴作為親魚，然后進行人工催產獲得團頭魴精子和錦鯉卵子，將經紫外線滅活的團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻撒在平鋪于水中的網片上，經5min后將被激活的錦鯉卵子置于5°C冷水中冷休克處理18 25min，冷休克處理后的胚胎在21V 23°C水溫下孵化，按照錦鯉繁殖常規方法進行孵化管理，生產出錦鯉雌核發育
二倍體魚苗。上述團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法中，所述挑選雌性錦鯉和雄性團頭魴作為親魚是指在繁殖前期挑選色斑切邊整齊、品種特征強烈、色質優異、體型良好、健康無病、性成熟特征明顯的雌性錦鯉和性成熟特征明顯、體質健康的雄性團頭魴作為親魚進行專池精養，使其性腺良好發育。上述團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法中，所述團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻撒在沉于水中的網片上是指團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻入水后完成卵子的激活，水溫保持在22 土 I C。上述團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法中，所述紫外線滅活的具體操作步驟為將所述團頭魴精液用Hank’ s液按體積比1:5的比例稀釋后均勻涂鋪于培養皿中，精液厚度不超過1_，再將培養皿置于墊有冰盤的搖床上，以紫外線進行照射，確保精液受到均勻處理。輻射源為I支20W的紫外燈管，波長253. 7nm,輻照度90 100 μ W/cm2。紫外燈管與精液面垂直距離為10 12cm。當60% 70%的團頭魴精子仍具有較好的活力時，停止照射，完成紫外線滅活處理。上述團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法中，所述紫外燈照射處理時間優選為
25 35min。本發明利用失活團頭魴精子啟動錦鯉卵子雌核發育以及染色體組加倍的措施，所誘導產生的后代只含有雌性親本的基因，可加速基因純合化，可用于錦鯉快速育種，同時也是進行錦鯉體色遺傳分析與性別控制的有效輔助手段。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明在繁殖季節前2 3個月挑選色斑切邊整齊、品種特征強烈、色質優異、體型良好、健康無病、性成熟特征明顯的雌性錦鯉和性成熟特征明顯、體質健康的雄性團頭魴作為親魚，進行專池精養，選用添加Ve的親魚配合飼料進行合理投喂，促進性腺良好發育。當水溫穩定在20 22°C時，挑選性腺發育良好、體質健壯的上述親魚，另選取2 3倍于雌性錦鯉數量的雄性錦鯉(用于刺激雌性錦鯉發情)，進行人工催產，混合注射LRH-A220 μ g/Kg, HCG1000IU/Kg，雄魚劑量減半，采用胸鰭基部一次注射法。注射催產劑后將雌、雄錦鯉放入同一產卵池，并設置魚巢，以檢測親魚的發情產卵情況；雄性團頭魴放入另一產卵池中。當發現錦鯉親魚在產卵池中激烈追逐時，將團頭魴雄魚撈出采集精液。將采集的團頭魴精液用Hank’ s液按體積比1:5稀釋均勻涂鋪于培養皿中，精液厚度不超過1mm，再將培養皿置于墊有冰盤的搖床上，以紫外線進行照射，確保精液受到均勻處理。輻射源為I支20W的紫外燈管，波長253. 7nm,輻照度92 μ W/cm2。紫外燈管與精液面垂直距離為IOcm0照射時間25 35min，視精子活力情況而定。在紫外線照射過程中，定時用牙簽沾一點精液置于載玻片上，用水激活后與顯微鏡下觀察其活性，當60% 70%的團頭魴精子仍具有較好的活力時，停止照射，完成紫外線滅活處理。將每一批紫外線滅活精子都放入小燒杯中，于4°C下在冰箱中黑暗保存。在紫外線處理精子即將完成時，采集錦鯉卵子，并將滅活團頭魴精子與錦鯉卵子混合，用干凈羽毛輕輕攪拌均勻，再將卵子均勻撒在平鋪于水中的網片上，水溫保持在22±1°C。孵育5min后，將粘附有被激活的錦鯉卵子的網片置于恒溫培養箱，在5°C冷水中冷休克處理20min，冷休克處理后的胚胎在21°C 23°C水溫下孵化。按照錦鯉繁殖常規方法進行孵化管理，生產出錦鯉雌核發育二倍體魚苗。本實施例所用的Hank’ s液配方如下NaC17. 5g, CaCl2O. 4g, KC10. 2g,加蒸懼水至1000ml, pH7. 0 7· 3。用單個仔魚染色體倍性檢測方法對本實施例中剛孵化出來的雌核發育錦鯉仔魚的體細胞染色體數目進行抽樣檢測，發現用團頭魴精子誘導的雌核發育錦鯉為二倍體(2η=100)。上述實施例中單個仔魚染色體制備步驟為隨機選取處理組仔魚10 20尾，用載玻片將單個仔魚壓碎，取組織塊，用O. 005mol/L秋水仙素處理2h，用O. 075mol/LKCL溶液低滲處理I. 5 2h,再用Carnoy’s固定液固定。用常規空氣干燥法制片，Giemsa染色。每個胚胎選擇10個左右清晰可數的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下鏡檢并拍照。用本實施例方法選育雌核發育錦鯉，可明顯提高人工雌核發育的成功率，表明團頭魴精子是進行錦鯉人工雌核發育的理想材料，在錦鯉體色遺傳規律研究和遺傳育種方面具有重要的生物學意義。 本發明技術方案所依據的科學原理雌核發育是單性生殖的一種，是指卵子只依靠本身的遺傳物質發育成為個體的生殖行為。卵子發育需要同源或異源精子進入卵內，但這些精子只起啟動作用，并不參與發育，胚胎發育完全在雌核控制之下進行，得到的子代全部是母性性狀，基因型與母本相同或略有差異。以上所述的實施例僅用于說明本發明的技術思想及特點，其目的在于使本領域內的技術人員能夠理解本發明的內容并據以實施，不能僅以本實施例來限定本發明的專利范圍，即凡本發明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發明的專利范圍內。
權利要求
1.一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，包括以下步驟首先挑選雌性錦鯉和雄性團頭魴作為親魚，然后進行人工催產獲得團頭魴精子和錦鯉卵子，將經紫外線滅活的團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻撒在平鋪于水中的網片上，經5min后將被激活的錦鯉卵子置于5°C冷水中冷休克處理18 25min，冷休克處理后的胚胎在21°C 23°C水溫下孵化，按照錦鯉繁殖方法進行孵化管理，生產出錦鯉雌核發育二倍體魚苗。
2.根據權利要求I所述的團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，所述紫外線滅活的具體操作步驟為將所述團頭魴精液用Hank’ s液按體積比1:5的比例稀釋后均勻涂鋪于培養皿中，精液厚度不超過1_，再將培養皿置于墊有冰盤的搖床上，以紫外線進行照射，確保精液受到均勻處理，輻射源波長波長253. 7nm,輻照度90 100 μ ff/cm2,紫外光源與精液面垂直距離為10 12cm，當60% 70%的團頭魴精子仍具有的活力時，停止照射，完成紫外線滅活處理。
3.根據權利要求2所述的團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，所述紫外燈照射處理時間為25 35min。
4.根據權利要求1、2或3所述的團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，所述挑選雌性錦鯉和雄性團頭魴作為親魚是指在繁殖前期挑選色斑切邊整齊、品種特征強烈、色質優異、體型良好、健康無病、性成熟特征明顯的雌性錦鯉和性成熟特征明顯、體質健康的雄性團頭魴作為親魚進行專池精養，使其性腺良好發育。
5.根據權利要求I所述的團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，所述團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻撒在沉于水中的網片上是指團頭魴精子與錦鯉卵子混合均勻入水后完成卵子的激活，水溫保持在22±1°C。
6.根據權利要求2所述的團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，其特征在于，所述每1000ml Hank，s 液中含有 NaC17. 5g, CaCl2O. 4g, KC10. 2g，溶質為蒸餾水，pH7. O 7· 3。
全文摘要
本發明公開了一種團頭魴精子誘導錦鯉雌核發育的方法，包括以下步驟首先挑選雌性錦鯉和雄性團頭魴作為親魚，然后進行人工催產獲得團頭魴精子和錦鯉卵子，將經紫外線滅活的團頭魴精液與錦鯉卵子混合均勻撒在平鋪于水中的網片上，經5min后將被激活的卵子置于5℃冷水中冷休克處理18～25min，冷休克處理后的胚胎在21℃～23℃水溫下孵化，獲得二倍體雌核發育錦鯉。本發明利用失活團頭魴精子啟動錦鯉卵子雌核發育以及染色體組加倍的措施，所誘導產生的后代只含有雌性親本的基因，可加速基因純合化，在錦鯉體色遺傳規律研究和遺傳育種方面具有重要的生物學意義。
文檔編號A01K61/00GK102919185SQ20121049121
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月27日 優先權日2012年11月27日
發明者梁擁軍, 張升利, 楊璞, 孫向軍, 史東杰, 張欣, 蘇建通, 孫硯勝 申請人:北京市水產科學研究所