專利名稱：煙草病毒病快速摩擦接種方法
技術領域：
本發明屬于煙草病毒接種技術領域，具體涉及一種煙草病毒病快速摩擦接種方法。
背景技術：
煙草作為一種模式植物，廣泛應用于生物技術研究領域，完成煙草全基因組測序將更利于煙草作為模式植物的生物技術研究。隨著煙草基因組計劃重大專項的啟動，“煙草突變體庫創制、篩選與分析”研究項目通過化學和生物方法創制并收獲了 15萬份煙草突變二代種子，并全面開展了煙草突變體庫抗TMV、CMV和PVY快速、高通量接種篩選鑒定。面對龐大的試驗群體，篩選方法應具備快速、簡易和準確的特點。目前，煙草病毒病的接種方法已有常規汁液摩擦接種法、噴槍接種法、傳毒介體接 種法。在煙草病毒病抗病性鑒定中，多采用常規汁液摩擦接種，該方法具有接種均勻、準確的優點，但需逐株摩擦接種，速度太慢；噴槍接種速度快，但在操作中只有熟練掌握好噴槍使用技術，才能做到接種均勻；傳毒介體接種僅適宜于煙蚜等傳毒介體傳播的病毒，且需要飼養無毒傳毒介體、再經獲毒、持毒和傳毒等多個階段，費時費力。另外，以上傳統方法均不適宜于大群體樣本的接種鑒定。綜上所述，如果能從簡單易行的角度出發，篩選出適宜于突變體庫的高通量接種方法，進而為煙草品種病毒病溫室苗期接種鑒定提供一種準確、可行的接種方法，這顯得尤為重要。
發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種煙草病毒病快速摩擦接種方法，該方法采用衣刷快速摩擦接種，易操作、發病率高，適宜于汁液摩擦傳播的病毒的大批量材料快速接種鑒定。本發明的目的是這樣實現的一種煙草病毒病快速摩擦接種方法，包括育苗，制備病毒液和接種步驟，其中在煙草苗的真葉上均勻噴灑石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。所述育苗步驟優選為先在30cmX20cm的塑料盤內播種育苗，待煙苗長至2_3片真葉時，假植到30孔的育苗盤內，整齊擺放于育苗畦內，待煙苗長至5-6片真葉時，均勻噴撒600目石英砂。所述制備病毒液的步驟優選為取病葉，加入0. 1M、pH7. 0的磷酸緩沖液，在滅菌研缽中或研磨機中研磨，紗布過濾，用所述磷酸緩沖液定容，得到病毒液。所述接種步驟為取衣刷消毒，沾取病毒汁液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜,每蘸取一次病毒汁液,來回摩擦2-4次，每次刷接50-70cm長，接種后噴灑清水沖洗殘留液。
所述衣刷包括刷頭主體和刷柄，刷頭主體的一面上設置刷毛；刷頭主體長15cm，寬4cm ;刷柄長14cm,寬2. 5cm ;刷毛長5cm,分四列合計4cm寬。本發明涉及的摩擦接種方法，采用衣刷蘸取一次病毒汁液，來回摩擦3次，每次可刷接60cm長，試驗取材容易，操作簡單、省時省力、準確可行，接種成功率100%。該方法適用于煙草普通花葉病(TMV)、煙草黃瓜花葉病(CMV)、煙草馬鈴薯Y病毒病(PVY))等通過機械汁液傳染的煙草病毒病，可用于煙草突變體庫、種質資源、新品種等大批量材料的苗期接種鑒定。
圖為接種用塑料衣刷；1_刷頭主體；2-刷柄；3_刷毛。
具體實施例方式具體地說，本發明實施例采用的接種方法，包括如下步驟I.育苗先在30CmX20Cm的塑料盤內播種育苗，待煙苗長至2-3片真葉時，假植到30孔的育苗盤內，整齊擺放于育苗畦內。待煙苗長至5-6片真葉時待用，接種前均勻噴撒600目石英砂。2.制備接種體接種體選用當地優勢株系或根據試驗需要選取，接種到系統寄主上繁殖保存。為了防止保存期病毒的致病性退化，在使用前15d，轉接到系統寄主上復壯I次，備用。取新鮮病葉，加入0. lM、pH7. 0的磷酸緩沖液，在滅菌研缽中研磨，紗布過濾，磷酸緩沖液定容(病葉與磷酸緩沖液的質量體積比為lg:40mL)，得到接種液，現配現用。當接種液需要量較大時，可使用每個病毒專用的組織粉碎研磨機制備接種液。3.塑料衣刷消毒取塑料衣刷，肥皂水浸泡30min消毒，清水洗凈。塑料衣刷如圖I所示，包括刷頭主體I和刷柄2，刷頭主體I的一面上設置刷毛3，刷頭主體長15cm，寬4cm ；刷柄長14cm,寬2. 5cm ;刷毛長5cm,分四列合計4cm寬。4.快速摩擦接種肥皂水洗手后，取塑料衣刷，手握刷柄用刷毛沾取病毒汁液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。每蘸取一次病毒汁液，來回摩擦3次，每次刷接60cm長。接種后噴灑清水沖洗殘留液。5.調查方法接種后15d，調查發病情況。病害嚴重度分級參考煙草病蟲害調查及分級標準(GB / T23222 — 2008)。以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。實施例I衣刷摩擦接種與常規摩擦接種發病率比較I. I試驗材料接種品種為三生-NN和NC89，先在30cmX20cm的塑料盤內播種育苗，待煙苗長至2-3片真葉時，假植到30孔的育苗盤內，整齊擺放于育苗畦內。待煙苗長至5-6片真葉時待用，試驗前均勻噴撒600目石英砂。I. 2試驗方法
衣刷摩擦接種肥皂水洗手后，用預先消毒的塑料衣刷沾取病毒汁液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。每蘸取一次病毒汁液，來回摩擦3次，每次刷接60cm長。常規摩擦接種肥皂水洗手后，左手托葉片，右手拿滅菌脫脂棉團蘸取病毒汁液，輕輕摩擦煙苗上部2片葉，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。每蘸取一次病毒汁液，來回摩擦3次，每株摩擦接種上部兩片葉。上述每處理30株，3次重復，煙苗接種后，噴灑清水沖洗殘留液，在25-28°C條件下培養，3d后調查TMV在三生NN煙上的枯斑癥狀，15d后調查CMV在系統寄主三生NN煙和PVY在系統寄主NC89上的發病率。I. 3試驗結果將衣刷快速摩擦接種的發病率，與常規摩擦接種發病率進行比較，結果發現兩種方法均能成功的接種TMV、CMV和PVY，發病率均為100%。較常規逐株摩擦接種，衣刷快速摩擦接種簡單易行、快速準確，更適于大批量材料的接種篩選試驗。表I不同接種方法發病率(％)
權利要求
1.一種煙草病毒病快速摩擦接種方法，包括育苗，制備病毒液和接種步驟，其特征在于在煙草苗的真葉上均勻噴灑石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液輕輕摩擦煙苗葉片， 以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。
2.根據權利要求I所述的煙草病毒病快速摩擦接種方法，其特征在于所述育苗步驟為先在30cmX20cm的塑料盤內播種育苗，待煙苗長至2_3片真葉時，假植到30孔的育苗盤內，整齊擺放于育苗畦內，待煙苗長至5-6片真葉時，均勻噴撒600目石英砂。
3.根據權利要求I所述的煙草病毒病快速摩擦接種方法，其特征在于所述制備病毒液的步驟為取病葉，加入O. 1Μ、ρΗ7. O的磷酸緩沖液，在滅菌研缽中或研磨機中研磨，紗布過濾，用所述磷酸緩沖液定容，得到病毒液。
4.根據權利要求I所述的煙草病毒病快速摩擦接種方法，其特征在于所述接種步驟為取衣刷消毒，沾取病毒汁液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜，每蘸取一次病毒汁液，來回摩擦2-4次，每次刷接50-70cm長，接種后噴灑清水沖洗殘留液。
5.根據權利要求I所述的煙草病毒病快速摩擦接種方法，其特征在于所述衣刷包括刷頭主體和刷柄，刷頭主體的一面上設置刷毛；刷頭主體長15cm，寬4cm ;刷柄長14cm，寬·2.5cm ;刷毛長5cm,分四列合計4cm寬。
全文摘要
本發明公開了一種煙草病毒病快速摩擦接種方法，包括育苗，制備病毒液和接種步驟，其中在煙草苗的真葉上均勻噴灑石英砂，然后采用消毒衣刷沾取病毒液輕輕摩擦煙苗葉片，以造成表皮細胞微傷而不死亡為宜。本發明涉及的摩擦接種方法，采用衣刷蘸取一次病毒汁液，來回摩擦3次，每次可刷接60cm長，試驗取材容易，操作簡單、省時省力、準確可行，接種成功率100％。
文檔編號A01G7/00GK102972218SQ20121046624
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者錢玉梅, 申莉莉, 王鳳龍, 楊金廣, 戰懷旭 申請人:中國農業科學院煙草研究所