專利名稱：一種以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法
一種以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方技術領域
本發明屬于通過組織培養獲得再生苗的方法，特別涉及一種通過珙桐組織(葉片) 培養獲得珙桐再生苗的方法。
背景技術：
珙桐(Davidia involucrata Baillon)亦稱為水梨子或纟鳥子樹，為珙桐科 (Davidiaceae)珙桐屬(Davidia)植物,是我國特有的單型屬珍稀樹種,作為第三紀古熱帶植物區系的孑遺種，被列為國家一級重點保護植物，需要加強保護。珙桐樹高1(Γ20米，開花時，其掠紅色頭狀花序和基部兩片包葉的結構形似白鴻，遠看就像一群白鴻棲息在綠陰叢中，因而也具有很高的觀賞價值。
珙桐用種子繁殖較為不易，往往發芽率低、發芽時間長，故目前多采用無性繁殖。 珙桐栽培中常用的無性繁殖方式包括扦插繁殖、嫁接繁殖、埋條繁殖和高壓繁殖等。但這些繁殖方式繁殖系數低、速度較慢，且成活率不高，所以現在城市綠化中還見不到珙桐的身影。針對這一現狀，采用組織培養方法來繁殖珙桐被越來越多的人所嘗試，目前關于珙桐組織培養的報道主要集中在對愈傷組織的誘導與培養上，關于再生體系的研究較少。在僅有的再生體系研究中，又多以珙桐冬芽或帶芽莖段做為外植體，在操作時需要采集在珙桐生長過程中非常重要的芽或莖，這會造成對珙桐這一瀕危植物的破壞。而現在以珙桐葉片為外植體的再生體系效率極低，僅有的成功報道其愈傷組織分化率僅為6%，這并不能滿足實際運用中的需要。發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，以提高珙桐葉片愈傷組織再生途徑的效率，獲得移栽成活率高的再生苗。
本發明所述以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，步驟如下
( I)珙桐葉片愈傷組織獲得
取滅菌后的幼嫩珙桐葉片，接種于愈傷組織誘導培養基上，避光培養25 30天， 得到珙桐葉片愈傷組織，所述愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織誘導培養基中含有吲哚丁酸I. 5^2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤O. 5^1. 5mg、蔗糖2(T30g和瓊脂粉 5^5. 8g，其 pH 值控制在 5. 8^6. I ；
(2)愈傷組織增殖
將步驟(I)獲得的珙桐葉片愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養基上，避光培養 If 28天，以使愈傷組織增大，所述愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織增殖培養基中含有吲哚丁酸I. 5^2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤f 2. 5mg、蔗糖2(T30g和瓊脂粉 5^5. 8g，其 pH 值控制在 5. 8^6. I ；
(3)誘導叢生芽
將步驟(2)增殖后的珙桐葉片愈傷組織切割后接種于芽分化培養基上，于光照強度150(Γ20001χ、光照時間l(Tl4h/d的光照條件下培養25 30天，以誘導叢生芽，所述芽分化培養基以MS為基礎培養基，每升芽分化培養基中含有吲哚丁酸O. 33 lmg、6-芐氨基腺嘌呤3 10mg、蔗糖20 30g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8 6. I ；
(4)叢生芽增殖
把步驟(3)獲得的叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上，于光照強度 150(Γ20001χ、光照時間l(Tl4h/d的光照條件下培養25 30天，以使叢生芽生長，所述芽增殖培養基以MS為基礎培養基，每升芽增殖培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤O. Γ0. 5mg、赤霉素O. I O. 5mg、蔗糖20 30g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8 6. I ；
(5)誘導生根
從步驟(4)增殖后的叢生芽上切下幼芽，接種于第一生根培養基中培養Te 天，再轉接到第二生根培養基中培養，在第二生根培養基中的培養時間以達到幼苗移栽要求為限(時間約25 30天)，用上述兩種生根培養基培養時的光照條件為光照強度為 150(Γ20001χ、光照時間l(Tl4h/d，所述第一生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第一生根培養基中含有生長素5 15mg、蔗糖15 20g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在 5. 8飛.1，所述第二生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第二生根培養基中含有活性炭f 2g、蔗糖15 20g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8^6. I。
上述方法中，步驟(I)至步驟(5)中的環境溫度優選22 26°C。
上述方法中，步驟(I)至步驟(5)中的環境濕度優選609Γ90%。
上述方法中，第一生根培養基中的生長素為吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一種。
上述方法中，基礎培養基MS的組成見“胡孔峰等.植物組織培養技術及應用 [Μ].鄭州河南科學技術出版社，2006” ； 1/2MS是將MS中大量元素母液組分(NH4NO3, KNO3, CaCl2 · 2H20, MgSO4 · 7H20, KH2PO4)的含量減半。
上述方法中，愈傷組織誘導培養基、愈傷組織增殖培養基、芽分化培養基、芽增殖培養基、第一生根培養基和第二生根培養基的PH值調節，采用濃度lmol/L的氫氧化鈉溶液或濃度lmol/L的鹽酸。
上述方法中，作為外植體的幼嫩珙桐葉片的滅菌可采用的外植體消毒方法有多種，常用消毒劑包括質量濃度7(Γ75%的乙醇、氯化汞溶液、次氯酸鈉溶液等。本發明優選的滅菌方法是首先在洗潔精稀釋溶液中浸泡以去除附著于葉片表面的污潰(時間約 lOmin)，然后用流水沖洗以去除雜質與洗潔精溶液(時間約I h)，再于無菌條件下依次用質量濃度75%的乙醇消毒(時間約30 S)、質量濃度0. 1%的氯化汞水溶液消毒(時間約4 min), 繼后從氯化汞水溶液中取出幼嫩珙桐葉片用無菌水沖洗去除殘留的消毒液。
本發明方法的有益效果愈傷組織的分化率較高，可達50%以上；生根條數多、質量好，生根率達100%，移栽成活率達90%以上，再生體系總體效率好，可以運用于再生植株的大量生產及農桿菌介導的遺傳轉化研究。此外，實施本發明方法只需簡單的植物組織培養設備即可，實用性強、操作簡便，且不受季節限制。
圖I是采集作為外植體的珙桐幼嫩葉片的枝條圖2是在誘導培養基上培養誘導出的珙桐葉片愈傷組織圖3是在增殖培養基上培養增殖后的珙桐愈傷組織圖4是在芽分化培養基上培養初期分化出的珙桐叢生芽圖5是在芽分化培養基上培養30天分化出的珙桐叢生芽圖6是將珙桐叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上培養前的狀態圖7是在芽增殖培養基上培養增殖后的珙桐叢生芽圖8是在芽增殖培養基上培養增殖后用于生根的珙桐再生苗圖9是接種于第二生根培養基中培養開始生根的珙桐再生苗圖10是接種于第二生根培養基中培養生根后生長良好的珙桐再生苗圖11是珙桐再生苗在第二生根培養基中的根系狀態圖12是珙桐再生苗的移栽后的狀態圖。
具體實施方式
下面結合附圖通過實施例對本發明所述以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法作進一步說明。
實施例I
本實施例中，幼嫩珙桐葉片從四川省彭州市銀廠溝風景區的成年珙桐植株上采集 (見圖1)，所述幼嫩珙桐葉片的滅菌操作如下將洗潔精(白貓牌)用自來水配制成稀釋液， 洗潔精與自來水的體積比為I : 1000，將所采集的幼嫩珙桐葉片在所述洗潔精稀釋液中浸泡IOmin后取出用自來水沖洗I h洗凈表面雜物，然后于無菌條件下用質量濃度75%的乙醇消毒30s，再投入質量濃度O. I %的氯化汞水溶液中消毒4 min，繼后取出用無菌水沖洗5 次即完成滅菌。將滅菌后的珙桐葉片用剪刀剪成大小約I cm2的小塊用于接種。
本實施例中，以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法步驟如下
( I)珙桐葉片愈傷組織獲得
使用IOOml的三角瓶，每瓶裝入約40ml愈傷組織誘導培養基，接種5飛塊滅菌后的珙桐葉片小塊(葉片背面朝上)，避光培養25天，得珙桐葉片愈傷組織(見圖2)，所述愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織誘導培養基中含有吲哚丁酸I. 5mg、 6-芐氨基腺嘌呤O. 5mg、蔗糖20g和瓊脂粉5g，其pH值控制在5. 8 ；
(2)愈傷組織增殖
將步驟(I)獲得的珙桐葉片愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養基上，避光培養18 天，以使愈傷組織增大(見圖3)，所述愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織增殖培養基中含有吲哚丁酸I. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤Img、蔗糖20g和瓊脂粉5g，其pH 值控制在5. 8 ；
(3)誘導叢生芽
將步驟(2)增殖后的珙桐葉片愈傷組織切割后接種于芽分化培養基上，于光照強度150(Γ20001χ、光照時間10h/d的光照條件下培養25天，以誘導叢生芽，所述芽分化培養基以MS為基礎培養基，每升芽分化培養基中含有吲哚丁酸O. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤3mg、蔗糖20g和瓊脂粉5g，其pH值控制在5. 8 ；
(4)叢生芽增殖
把步驟(3)獲得的叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上，于光照強度 150(Γ20001χ、光照時間10h/d的光照條件下培養25天，以使叢生芽生長，所述芽增殖培養基以MS為基礎培養基，每升芽增殖培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤O. lmg、赤霉素O. lmg、蔗糖20g和瓊脂粉5g，其pH值控制在5. 8 ；
(5)誘導生根
從步驟(4)增殖后的叢生芽上切下芽高2. 5cm以上的幼芽，接種于第一生根培養基中培養3天，再轉接到第二生根培養基中培養25天得生根后可移植的珙桐再生苗，用上述兩種生根培養基培養時的光照條件為光照強度為150(Γ20001χ、光照時間10h/d，所述第一生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第一生根培養基中含有生長素吲哚乙酸5 mg、蔗糖15g和瓊脂粉5g，其pH值控制在5. 8，所述第二生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第二生根培養基中含有活性炭2g、蔗糖15g和瓊脂粉5g，其pH值控制在 5. 8。
上述步驟(I)至步驟(5)中的環境溫度控制在22°C，環境濕度控制在70%。
(6)移植
將生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室溫下煉苗4天，取出小苗用自來水沖洗凈第二生根培養基后用稀釋1000倍的多菌靈液浸泡lh，再移栽在高壓滅菌的營養土 蛭石的質量比=2:1的栽培基質上。
本實施例中，叢生芽分化率為50%，生根率100%，移栽成活率91%。
實施例2
本實施例中，幼嫩珙桐葉片從四川省蛾眉山市蛾眉山風景區的成年珙桐植株上采集，所述幼嫩珙桐葉片的滅菌操作與實施例I相同。將滅菌后的珙桐葉片用剪刀剪成大小約I Cm2的小塊用于接種。
本實施例中，以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法步驟如下
( I)珙桐葉片愈傷組織獲得
使用IOOml的三角瓶，每瓶裝入約40ml愈傷組織誘導培養基，接種5飛塊滅菌后的珙桐葉片小塊(葉片背面朝上)，避光培養28天，得珙桐葉片愈傷組織，所述愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基,每升愈傷組織誘導培養基中含有11引哚丁酸2mg、6-節氨基腺嘌呤lmg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 2g，其pH值控制在6. O ；
(2)愈傷組織增殖
將步驟(I)獲得的珙桐葉片愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養基上，避光培養21 天，以使愈傷組織增大，所述愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織增殖培養基中含有吲哚丁酸2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤I. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 2g,其pH值控制在6. O ；
(3)誘導叢生芽
將步驟(2)增殖后的珙桐葉片愈傷組織切割后接種于芽分化培養基上，于光照強度150(Γ20001χ、光照時間12h/d的光照條件下培養30天，以誘導叢生芽(見圖4、5)，所述芽分化培養基以MS為基礎培養基，每升芽分化培養基中含有吲哚丁酸O. 33mg、6-芐氨基腺嘌呤5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 2g，其pH值控制在6. O ；
(4)叢生芽增殖
把步驟(3)獲得的叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上(見圖6)，于光照強度 150(Γ20001χ、光照時間12h/d的光照條件下培養30天，以使叢生芽生長(見圖7)，所述芽增殖培養基以MS為基礎培養基，每升芽增殖培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤O. 25mg、赤霉素O.5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 2g，其pH值控制在6. O ；
(5)誘導生根
從步驟(4)增殖后的叢生芽上切下芽高2. 5cm以上的幼芽，接種于第一生根培養基中培養4天(見圖8)，再轉接到第二生根培養基中培養30天得生根后可移植的珙桐再生苗，用上述兩種生根培養基培養時的光照條件為光照強度為150(Γ20001χ、光照時間12h/ d，所述第一生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第一生根培養基中含有生長素吲哚丁酸10mg、蔗糖20g和瓊脂粉5. 2g，其pH值控制在6. 0，所述第二生根培養基以1/2MS 培養基為基礎培養基，每升第二生根培養基中含有活性炭lg、蔗糖15g和瓊脂粉5. 2g，其pH 值控制在6. O。
上述步驟(I)至步驟(5)中的環境溫度控制在24°C，環境濕度控制在60%。
(6)移植
將生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室溫下煉苗4天，取出小苗用自來水沖洗凈第二生根培養基后用稀釋1000倍的多菌靈液浸泡lh，再移栽在高壓滅菌的營養土 蛭石的質量比=2:1的栽培基質上。
本實施例中，叢生芽分化率為53%，生根率100%，移栽成活率94%。
實施例3
本實施例中，幼嫩珙桐葉片從四川省雅安市滎經縣龍蒼溝自然保護區的成年珙桐植株上采集，所述幼嫩珙桐葉片的滅菌操作與實施例I相同。將滅菌后的珙桐葉片用剪刀剪成大小約I Cm2的小塊用于接種。
本實施例中，以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法步驟如下
( I)珙桐葉片愈傷組織獲得
使用IOOml的三角瓶，每瓶裝入約40ml愈傷組織誘導培養基，接種5飛塊滅菌后的珙桐葉片小塊(葉片背面朝上)，避光培養30天，得珙桐葉片愈傷組織(見圖2)，所述愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織誘導培養基中含有吲哚丁酸2. 5mg、 6-芐氨基腺嘌呤I. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 8g，其pH值控制在6. I ；
(2)愈傷組織增殖
將步驟(I)獲得的珙桐葉片愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養基上，避光培養28 天，以使愈傷組織增大，所述愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織增殖培養基中含有吲哚丁酸2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤2. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 8g，其pH值控制在6. I ；
(3)誘導叢生芽
將步驟(2)增殖后的珙桐葉片愈傷組織切割后接種于芽分化培養基上，于光照強度150(Γ20001χ、光照時間14h/d的光照條件下培養28天，以誘導叢生芽，所述芽分化培養基以MS為基礎培養基，每升芽分化培養基中含有吲哚丁酸lmg、6-芐氨基腺嘌呤10mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 8g，其pH值控制在6. I ；
(4)叢生芽增殖
把步驟(3)獲得的叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上，于光照強度 150(Γ20001χ、光照時間14h/d的光照條件下培養28天，以使叢生芽生長，所述芽增殖培養基以MS為基礎培養基，每升芽增殖培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤O. 5mg、赤霉素O. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉5. 8g，其pH值控制在6. I ；
(5)誘導生根
從步驟(4)增殖后的叢生芽上切下芽高2. 5cm以上的幼芽，接種于第一生根培養基中培養6天，再轉接到第二生根培養基中培養28天得生根后可移植的珙桐再生苗(見圖 9、10、11)，用上述兩種生根培養基培養時的光照條件為光照強度為150(Γ20001Χ、光照時間14h/d,所述第一生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基,每升第一生根培養基中含有生長素萘乙酸15mg、蔗糖20g和瓊脂粉5. 8g，其pH值控制在6. I，所述第二生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第二生根培養基中含有活性炭lg、蔗糖20g和瓊脂粉 5. 8g，其pH值控制在6. I。
上述步驟(I)至步驟(5)中的環境溫度控制在26°C，環境濕度控制在90%。
(6)移植
將生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室溫下煉苗4天，取出小苗用自來水沖洗凈第二生根培養基后用稀釋1000倍的多菌靈液浸泡lh，再移栽在高壓滅菌的營養土 蛭石的質量比=2:1的栽培基質上(見圖12)。
本實施例中，叢生芽分化率為50%，生根率100%，移栽成活率90%。
權利要求
1.一種以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，其特征在于步驟如下 (1)珙桐葉片愈傷組織獲得 取滅菌后的幼嫩珙桐葉片，接種于愈傷組織誘導培養基上，避光培養25 30天，得珙桐葉片愈傷組織，所述愈傷組織誘導培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織誘導培養基中含有吲哚丁酸I. 5^2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤O. 5^1. 5mg、蔗糖2(T30g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8^6. I ； (2)愈傷組織增殖 將步驟(I)獲得的珙桐葉片愈傷組織接種于愈傷組織增殖培養基上，避光培養18 28天，以使愈傷組織增大，所述愈傷組織增殖培養基以MS為基礎培養基，每升愈傷組織增殖培養基中含有吲哚丁酸I. 5^2. 5mg、6-芐氨基腺嘌呤f 2. 5mg、蔗糖2(T30g和瓊脂粉5^5. 8g，其 pH 值控制在 5. 8^6. I ； (3)誘導叢生芽 將步驟(2)增殖后的珙桐葉片愈傷組織切割后接種于芽分化培養基上，于光照強度150(Γ20001χ、光照時間l(Tl4h/d的光照條件下培養25 30天，以誘導叢生芽，所述芽分化培養基以MS為基礎培養基，每升芽分化培養基中含有吲哚丁酸O. 33 lmg、6-芐氨基腺嘌呤3 10mg、蔗糖20 30g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8 6. I ； (4)叢生芽增殖 把步驟(3)獲得的叢生芽切割后接種于芽增殖培養基上，于光照強度150(Γ2(ΚΚ)1Χ、光照時間l(Tl4h/d的光照條件下培養25 30天，以使叢生芽生長，所述芽增殖培養基以MS為基礎培養基，每升芽增殖培養基中含有6-芐氨基腺嘌呤O. Γ0. 5mg、赤霉素O. Γ0. 5mg、蔗糖2(T30g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8^6. I ； (5)誘導生根 從步驟(4)增殖后的叢生芽上切下幼芽，接種于第一生根培養基中培養:Γ6天，再轉接到第二生根培養基中培養，在第二生根培養基中的培養時間以達到幼苗移栽要求為限，用上述兩種生根培養基培養時的光照條件為光照強度為150(Γ20001χ、光照時間l(Tl4h/d，所述第一生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第一生根培養基中含有生長素5 15mg、蔗糖15 20g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8飛· 1，所述第二生根培養基以1/2MS培養基為基礎培養基，每升第二生根培養基中含有活性炭l 2g、蔗糖15 20g和瓊脂粉5 5. 8g，其pH值控制在5. 8^6. I。
2.根據權利要求I所述以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，其特征在于步驟(I)至步驟(5 )中的環境溫度控制在22 26 V。
3.根據權利要求I或2所述以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，其特征在于步驟(I)至步驟(5)中的環境濕度控制在60°/Γ90%。
4.根據權利要求I或2所述以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，其特征在于第一生根培養基中的生長素為吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一種。
5.根據權利要求3所述的以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，其特征在于第一生根培養基中的生長素為吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一種。
全文摘要
一種以珙桐葉片為外植體的組織培養獲得珙桐再生苗的方法，步驟如下(1)珙桐葉片愈傷組織獲得；(2)愈傷組織增殖；(3)誘導叢生芽；(4)叢生芽增殖；(5)誘導生根。上述方法中，步驟(1)至步驟(5)中的環境溫度為22~26℃，環境濕度優選60%~90%。使用上述方法，愈傷組織的分化率較高，可達50%以上；生根率達100%，移栽成活率達90%以上。
文檔編號A01H4/00GK102919129SQ201210457129
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者徐鶯, 陳蕤坤, 陳放 申請人:四川大學