高通量克隆植物抗病基因的方法

高通量克隆植物抗病基因的方法
【專利摘要】本發明公開了一種高通量克隆植物抗病基因的方法。該方法通過生物信息學手段篩選候選抗病基因；然后利用高抗品種或近緣物種作為抗性基因源，大量克隆并轉化這些候選基因到感病品種中，利用病原菌侵染的方法對其抗病能力做評估，從而最終找到在生產上具有重要價值的廣譜高抗的植物抗病基因。本發明還公開了用該方法篩選到的稻瘟病抗性基因。
【專利說明】高通量克隆植物抗病基因的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物功能性基因的克隆與利用領域，特別是涉及以抗病基因的分子遺傳與進化分析為基礎，進行植物抗病基因高通量克隆的新方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]植物抗病基因是植物與病原菌長期相互作用的結果，在植物的進化過程中扮演著十分重要的角色。自從第一個植物抗病基因Hml在1992年被Johal和Briggs從玉米中分離以來(Tanksley et al.2007 ;董玉琢，2001)，到目前為止，已經接近100個植物抗病基因從不同的植物中得以克隆和分離，其中主要類型的抗病基因為NBS-LRR結構類型(Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat,即核苷酸結合位點和富亮氨酸重復蛋白)的抗病基因；另外還有少部分抗病基因主要為eLRR-TM-pkinase、eLRR-TM、STK等類型。這些抗病基因分別編碼對病毒、細菌、真菌、卵菌、甚至線蟲和昆蟲等的抗性蛋白。
[0004]由于植物病害每年給農、林生產帶來巨大的損失，合理有效地防治植物病害是保障農、林可持續發展所必須解決的關鍵問題之一。大量實踐證明，開發和利用已有的植物抗病種質資源是防治植物病害的最為有效的方法之一(Tanksley et al.2007 ;董玉琢，2001)。傳統的抗病品種培育，通常是將優質高產的品種與抗病性強的材料雜交，然后通過不斷的回交選育，最后得到抗病且優質的新品種。盡管這一方法十分有效，但極其耗時，當新品種培育出來之后，可能對病原囷新進化廣生的株系或小種表現為感病(Tanksley etal.2007);經典的圖位克隆方法利用抗病和感病的品種雜交，然后對大量的分離后代接種病菌、鑒定抗性、遺傳作圖等，`最后在精確遺傳定位的基礎上進行克隆。這種方法取得了很好的效果，在植物抗病基因的克隆中起到了非常重要的作用(如抗白葉枯病基因Xa21的分離和利用，Song et al.1995)，但因其周期長、費時費力、分離和等位性檢測較難等原因，不適合大量克隆抗病基因的需要。同時，但抗病基因獨特的遺傳方式，也使該方法的應用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因為例，該類基因在基因組中通常成簇(genecluster)分布(Wang et al.1999;Liu et al.2002; Lin et al.2007),在不同品種的同源染色體間的位置和結構也多呈不對稱分布，等位關系不明確，拷貝數變異大(Yang etal.2007; Ding et al.2007a; Sun et al.2008; Li et al.2010)。這些遺傳現象，大大增加了圖位克隆的難度，嚴重影響了抗病基因的克隆效率。
[0005]近年來，隨著植物抗病及抗病相關基因分子水平研究的突破性的進展，使我們對植物抗病及抗病相關基因的結構、功能、起源、變異及保存的認識有了根本性的變化。即植物抗病基因，主要是一類含有LRR結構域的基因，其中又以NBS-LRR (核酸結合-富含亮氨酸)類型抗病基因為主。由于這些基因在結構與功能上都具有高度的相似性，結合其獨特的遺傳與進化特征，為快速的克隆與鑒定這些基因提供了便利，也為高效地利用抗病種質資源提供了新的機遇。
[0006]本發明的主要目的就是充分利用植物抗病基因結構上的相似性及獨特的遺傳變異與進化特征，提供一種高效、快速的植物抗病基因的克隆方法。另外，雖然植物的種類繁多，但基本規律都非常一致。因此，本發明主要以水稻抗稻瘟病基因的高通量克隆為實例進行闡述。
[0007]水稻iOryza sativa)是世界上最重要的糧食作物之一，同時也是我國最主要的栽培作物之一，但其每年都遭受到嚴重的病蟲害的侵擾，給農業生產帶來了巨大的損失。其中，稻瘟病是分布最廣、危害水稻最嚴重的病害之一，嚴重影響到水稻的產量，全球每年由稻痕病引起的水稻產量損失占11-30% (約合1.57億美元,http://www.fungalgenomics.ncsu.edu)，直接威脅到稻農增收和國家的糧食安全。無論在世界還是在我國，解決稻瘟病難題一直也是保障水稻持續生產的一個優先研究的課題。
[0008]稻瘟病防治的最大困難之一是病菌本身變異與分化速度快(凌忠專等，2004)。新的稻痕病菌生理小種層出不窮，已有的抗病基因(Plant disease resistance, R基因)很快喪失抗性，而尋找新的抗病材料越來越難，水稻稻痕病對水稻生產的威脅也越來越大。對應易變的病原菌，水稻必須擁有很多抗病基因。從已經定位的70-80個基因位點來看，水稻抗稻瘟病基因數量眾多。但是，到目前為止已經克隆的抗稻瘟病基因僅15個。雖然已經定位的基因可以通過分子標記輔助選擇的方法加以利用，這一選育過程繁瑣、耗時，當新品種培育出來之后，可能對新產生的變異菌株表現為感病，克隆并直接轉化抗病基因可能是最直接有效的培育抗病品種的途徑。在這樣的背景下，使用新的思路，研究開發出能夠高通量克隆抗稻瘟病基因的新技術，就顯得尤為重要并且具有難以估量的價值。
[0009]

【發明內容】

[0010]本發明的目的是建立多對多植物抗病基因的克隆技術體系(多個克隆對應多個病原的檢測)，并以水稻抗稻瘟病基因的高通量克隆為實例進行闡述。我們的研究表明，植物抗病基因在遺傳和演化上主要具有以下幾個特點:
[1)物種內的高遺傳變異性；[2)多以基因家族和基因簇的形式存在，并表現出拷貝數的變化(Copy number variation) ;(3丨演化過程中多受到正選擇作用；(4)同類型抗病基因在系統進化樹上具有一定的聚類特性。該方法以這些遺傳演化規律為理論基礎，采用生物信息學方法，結合系統進化樹上的聚類及基因家族的分布特征，挑選物種內及物種間已知抗病功能基因同枝或附近枝基因作為候選的抗病基因；或根據寄主抗病基因與相應病原菌共進化的原則，對進化快的病菌，選取變異多、拷貝數多、進化快的寄主基因作為抗該種病害的候選抗病基因。反之，則選相對保守的寄主基因作候選抗病基因。利用分子生物學技術，大量、快速克隆這些候選基因，并通過轉基因來驗證其功能的有效性。實驗證明，該方法簡便，高效，方便鑒定，適合大量克隆抗病基因的需要，可以多、快、好、省的為植物供給新的抗病基因。
[0011]本發明技術的解決方案是:利用抗病基因與病原菌之間多對多的原則，建立高通量克隆植物抗病基因的方法，并以高通量克隆水稻抗稻瘟病基因為實施例進行闡明。主要包括以下幾個步驟:
(1)以植物抗病基因的遺傳變異特點和自然演化規律為基礎，在系統進化樹的基礎上，選取具有以下特征的基因作為抗某種病害的候選基因:(1)挑選物種內及物種間已知抗病功能基因同枝或附近枝基因作為候選的抗病基因；(2)根據寄主抗病基因與相應病原菌共進化的原則，對進化快的病菌，選取變異多、拷貝數多、進化快的寄主基因作為抗該種病害的候選抗病基因。反之，則選相對保守的寄主基因作候選抗病基因。具體到水稻抗稻瘟病基因為，在系統進化樹上選取與已知抗稻瘟病基因或抗真菌類基因同枝或附近枝的基因作為候選基因，或水稻基因組內進化速度快的基因家族(如多拷貝且拷貝數變化的、選擇作用明顯等)作為候選基因群。在抗性品種或近緣物種中克隆這些基因并通過轉基因來驗證其功能的有效性。
[0012](2)挑選合適的植物抗性品種作為基因克隆的材料，以抗稻瘟病為例，選取的近緣物種主要為禾本科植物與水稻近緣的物種:如野生稻、玉米、高粱、短柄草、燕麥、黑麥、小麥、大麥等物種，或水稻物種內的高抗品種，如Tetep、谷梅、地谷、明恢63及野生稻等。
[0013](3)用長片段PCR技術(Long-PCR)的方法克隆經過挑選的候選基因，通過測序檢測基因的完整性；將這些基因構建到雙功能載體中。
[0014](4)選擇感病品種作為受體植株，用農桿菌介導等合適的轉基因方法，將候選基因轉到普感品種中。
[0015](5)利用自然的病原菌接種感染，篩選鑒定抗病個體，鑒定抗病個體的新的抗病基因。以抗稻瘟病基因的高通量克隆為例，選取不同來源、不同時間收集的或生產上流行的稻瘟病菌株為病原，篩選抗性植株。
[0016](6)用Cre-1ox重組酶等體系去除被篩選個體轉基因過程中的標記基因，使具有新抗病基因的植株只保留天然的DNA序列。
[0017](7)結合農藝性狀的篩選，育成有推廣價值的新品種。
[0018]本發明的另一個目`的是提供實施例一、實施例二和實施例三中稻瘟病抗性基因(RMglO-RMg36)的DNA序列及編碼的蛋白質序列。
[0019]本發明的另一個目的是提供含有上述抗性基因的載體。
[0020]本發明的另一個目的是提供上述載體轉化的轉基因植株。
[0021]本發明的另一個目的是提供上述蛋白質在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
[0022]本發明實施例中涉及克隆和鑒定一種包含抗性基因(RMglO_RMg36)的DNA片段，這些基因編碼的蛋白能使水稻對稻瘟病菌所引起的病害產生特異性的抗病反應。其中所述片段分別如序列表SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 27所示或者基本上相當于SEQ ID NO: 1- SEQID NO:27所示，或者其功能相當于SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO:27所示序列的亞片段。這些DNA序列編碼的蛋白都屬于NBS-LRR類蛋白。其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID NO:28-SEQ ID NO:54 所示。
[0023]本發明同樣包括將抗性基因(RMglO_RMg36)中編碼不同結構域的片段(如NBS或LRR)與其他核苷酸片段重組，從而構成嵌合基因或蛋白質，使之具有新的功能。對抗性基因(RMglO-RMg36)進行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。例如，將LRR區域替換為其他抗性基因的結構域，或將NBS結構域進行定點突變，可能會導致基因抗性的喪失或抗譜的改變。
本發明也包括將抗性基因(RMglO-RMg36)的主要結構有效地連接上合適的調節序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物。這種基因可以是天然的或嵌合的。
[0024]本發明提供的稻瘟病抗性基因(RMglO_RMg36)具有重要的應用價值。將所述的抗性基因(RMglO-RMg36)序列用任何一種轉化方法導入水稻或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因抗病品種，從而應用于生產。本發明所述的基因構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列適當修飾，也可以用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬抗譜或增強抗性。
[0025]本發明具有如下有益效果:將克隆的抗稻瘟病基因轉入感病的植物中，有助于獲得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物種間轉移并利用，從而能夠克服傳統抗病育種中遠緣雜交的困難。此外，可以用轉基因技術在植物中累加多個抗病基因，縮短育種周期。本發明還能夠進一步提供或應用上述DNA片段獲得的抗病轉基因植株和相應的種子，以及用本發明的基因或基于該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發明的基因轉入其他植株。
[0026]本發明的特點是根據植物抗病基因的遺傳進化規律，采用生物信息學方法篩選潛在的抗病基因，并利用分子生物學技術大量、快速克隆候選抗病基因。方法簡便，效率高，方便鑒定，適合大量克隆抗病基因的需要，有效克服了傳統圖位克隆周期長、費時費力、分離和等位性檢測較難等缺點，從而可以多、快、好、省的為水稻生產持續供給新的抗性基因。
[0027] 【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發明流程不意圖。圖1A:抗稻痕病候選位點的確定；圖1B-E:抗稻痕病基因的分離與克隆；圖1F-G:抗稻瘟病基因的遺傳轉化；圖1H:轉化體的鑒定。
[0029]圖2為實施例中稻瘟病抗性基因的轉化體的潮霉素抗性基因和CaMV 35S啟動子的PCR檢測電泳圖；圖1A為CaMV 35S啟動子的PCR擴增產物，泳道1_6為轉化體的PCR擴增產物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質粒的PCR擴增產物，泳道8為受體新2號的非轉化體的PCR擴增產物；圖1B為潮霉素抗性基因的PCR產物，泳道1-6為轉化體的PCR擴增產物，泳道7為載體pCAMBIA1300-AscI質粒的PCR擴增產物，泳道8為受體新2號的非轉化體的PCR擴增產物。
[0030]圖3為實施例中植株抗性鑒定圖。圖3A:對照植株的抗性鑒定圖；圖3B:稻瘟病抗性基因的轉化植株的抗性鑒定圖。
[0031]
【具體實施方式】
[0032]候選抗病基因的確定原則:以植物抗病基因的遺傳變異特點和自然演化規律為基礎，在系統進化樹的基礎上，挑選物種內及物種間已知抗病功能基因同枝或附近枝基因作為候選的抗病基因；或根據共進化關系及基因家族的分布情況，挑選基因組內候選的抗病基因。
[0033]具體到水稻抗稻瘟病候選基因的確定:以禾本科已經完全測序基因組為分析基礎，如水稻全基因組測序品種93-11和日本晴，玉米、高粱、短柄草等，首先鑒定基因組中所有的NBS-LRR類型的抗病基因，并進行系統進化樹的構建，在系統進化樹的基礎上，將已知抗真菌(稻瘟病原菌為真菌)的所有抗病基因定位在系統進化樹上，或水稻基因組內變異多、拷貝數多、進化快的基因家族作為候選基因群。根據這一原則，我們共選取了近百個候選的抗稻瘟病基因位點，通過引物設計、在水稻近緣物種，如玉米、高粱、短柄草等，以及抗稻瘟病的水稻品種及野生稻品種中進行長片段PCR、載體構建、轉基因、抗性鑒定等過程，最后通過30個來源于中國大陸分布所有水稻主產區的稻瘟病菌系統鑒定，鑒定出27個抗稻瘟病基因。
[0034]下面通過具體的實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規方法。
[0035]實施例一:候選抗稻瘟病基因位點Rpl/Pi37和Rp3/Pc的克隆及鑒定
1、抗稻瘟病候選位點Rpl/Pi37和Rp3/Pc的確定:在Rpl/Pi37基因位點:Rpl基因為玉米抗銹病(真菌)基因，而Pi37為水稻抗稻瘟病(真菌)基因，從系統進化樹上看，二者聚在同一進化枝，具有明顯的聚類性；同時，在這一進化枝中，玉米和高粱中均存在不同程度的基因擴張且有新近產生的基因簇，表現出進化速度快的特征。在Rp3/Pc基因位點:Rp3基因為玉米抗銹病(真菌)基因，而Pc為高粱中抗根腐病(真菌)的基因，從系統進化樹上看，二者聚在同一進化枝，具有明顯的聚類性；同時，在這一進化枝中，玉米和高粱中均存在不同程度的基因擴張且有新近產生的基因簇，表現出進化速度快的特征。這兩個位點均符合抗病基因候選位點的基本特征，因此作為候選位點進行克隆與鑒定。
[0036]2、候選抗稻瘟病基因位點Rpl/Pi37和Rp3/Pc基因的分離與克隆:利用公共數據庫測序品種為參考序列(水稻=Nipponbare和93-11，高粱:BTx623，玉米:B73，短柄草:Bd21)設計引物。引物序列見序列表SEQ ID NO:55- SEQ ID N0:68。
[0037]分別以各禾本科植物DNA為模板，含各種高粱(SSQ，P49, Jinzall, saozhouB,X622, T607)、玉米(B73, Mo 17,齊 319，414，黃早四，齊 205，沈 317，Btl, 178)、短柄草(Bd21)及水稻(Tet印，谷梅2號，明恢63，Tadukan)等DNA，利用長片段PCR技術(Long-PCR)擴增候選基因片段。PCR程序如下:95°C預變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復性45秒，68°C延伸6分鐘`，共35個循環，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對PCR產物進行割膠純化，并電泳檢測。
[0038]3、雙功能基礎載體的準備:將稀有酶切位點AscI導入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點BamHI和SalI之間，取代酶切位點XbaI，構成基礎載體pCAMBIA1300-AscI。
[0039]設計5 ‘端分別帶有BamHI和AscI的引物擴增Pi9基因的啟動子序列，用限制性內切酶BamHI和AscI同時酶切啟動子的PCR產物和基礎載體pCAMBIA1300_AscI，連接獲得含有Pi9啟動子的載體Pi9-pro-vector。再設計引物5 ‘端分別帶有AscI和SalI的引物擴增Pi9基因的終止子序列，用限制性內切酶AscI和SalI同時酶切終止子的PCR產物和載體Pi9-pro_vector,連接最終獲得Pi9的基礎載體Pi9_ vector。
[0040]4、候選抗性基因與基礎載體的連接:用限制性內切酶AscI，同時酶切PCR產物與基礎載體質粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎載體pCAMBIA1300-AscI，通過菌落PCR，挑取陽性單克隆，搖菌提取質粒，測序，檢測。由此我們一共成功克隆了 30個基因。
[0041]5、候選抗性基因的遺傳轉化:將攜有候選基因的雙功能載體導入根癌農桿菌EHA105，采用農桿菌介導法，將候選基因轉化到水稻普感品種新2號和TP309中。最后一共獲得55株獨立的轉化體。
[0042]6、PCR分子檢測:以轉化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動子的特異性引物對其進行PCR反應。潮霉素抗性基因的引物序列見序列表SEQ ID NO: 109和SEQ ID N0:110oCaMV35S啟動子的引物序列見序列表SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112。
[0043]7、轉化體的抗性鑒定:選擇12個來源地不同，區別力好的獨立稻瘟病菌生理小種作為檢測的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉基因植株和對照品種，篩選抗病性改變的轉化體。最后一共鑒定獲得了 11個具有抗性的株系，7個具有抗性的新基因(RMglO-RMgl6)。
[0044]8、候選抗稻瘟病基因位點Rpl/Pi37和Rp3/Pc蛋白結構分析:采用步移法對獲得的抗病基因的DNA序列進行測序，所述7個具有抗性的新基因RMglO-RMgl6的DNA序列分別如SEQ ID NO: 1-7所示，其編碼的蛋白質分別如SEQ ID N0:28_34所示。
[0045]實施例二:候選抗稻瘟病基因位點AC134922的克隆及鑒定
1、抗稻瘟病候選位點AC134922的確定:AC134922位點是水稻基因組含最多拷貝數的抗病基因家族位點之一，該位點在4個禾本科近緣物種(水稻，玉米，高粱和短柄草)中拷貝數不同，在水稻和玉米中均存在明顯的基因擴張且有新近產生的基因簇；且在水稻不同個體間存在明顯的基因拷貝數的變化，表現出進化速度快的特征；符合抗病基因候選位點的基本特征，因此作為候選位點進行克隆與鑒定。
[0046]2、候選抗稻瘟病基因位點AC134922的分離與克隆:利用公共數據庫測序品種日本晴(Nipponbare)和93-11為參考序列，設計引物。引物序列見序列表SEQ ID N0:69_SEQID N0:72。
[0047]以抗病水稻品種Tet印，谷梅2號，明恢63及Tadukan的基因組DNA為模板，利用長片段PCR技術(Long-PCR )擴增候選基因片段。PCR程序如下:95°C預變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復性45秒，68°C延伸6分鐘，共35個循環，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對PCR產物進行割膠純化，并電泳檢測。
[0048]3、雙功能基礎載體的準備:將稀有酶切位點AscI導入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點BamHI和SalI之間，取代酶切位點XbaI，構成基礎載體pCAMBIA1300-AscI。
[0049]4、候選抗性基因與基礎載體的連接:用限制性內切酶AscI，同時酶切PCR產物與基礎載體質粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎載體pCAMBIA1300-AscI，通過菌落PCR，挑取陽性單克隆，搖菌提取質粒，測序，檢測。由此我們一共成功克隆了 8個基因。
[0050]5、候選抗性基因的遺傳轉化:將攜有候選基因的雙功能載體導入根癌農桿菌EHA105，采用農桿菌介導法，將候選基因轉化到水稻普感品種新2號和TP309中。最后一共獲得14株獨立的轉化體。
[0051]6、PCR分子檢測:以轉化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動子的特異性引物對其進行PCR反應。潮霉素抗性基因的引物序列見序列表SEQ ID NO: 109和SEQ ID N0:110oCaMV35S啟動子的引物序列見序列表SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112。
[0052]7、轉化體的抗性鑒定:選擇12個來源地不同，區別力好的獨立稻瘟病菌生理小種作為檢測的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉基因植株和對照品種，篩選抗病性改變的轉化體。最后一共鑒定獲得了 4個具有抗性的株系，2個具有抗性的新基因(RMgl7和 RMgl8)0
[0053]8、候選抗稻瘟病基因位點AC134922抗病基因蛋白結構分析:采用步移法對抗病基因的DNA序列進行了測序，所述2個具有抗性的新基因RMgl7和RMgl8的DNA序列分別如SEQ ID N0:8-9所示，其編碼的蛋白質分別如SEQ ID N0:35_36所示。
[0054]實施例三:水稻全基因組范圍內候選抗稻瘟病基因位點的克隆及鑒定
1、抗稻瘟病候選位點的確定:依據挑選原則，即挑選物種內及物種間已知抗病功能基因同枝或附近枝基因作為候選的抗病基因；或根據基因家族的分布情況，挑選表現出進化速度快特征的基因家族(如變異多、拷貝數多等)作為候選的抗病基因，一共挑選出90個候選基因位點，在水稻普抗品種中進行系統的抗病基因克隆。
[0055]2、候選抗稻瘟病基因位點的分離與克隆:利用公共數據庫測序品種為參考序列(水稻:Nipponbare和93-11)設計引物。引物序列見序列表SEQ ID N0:73_SEQ ID NO: 108?
[0056]以水稻Tet印，谷梅2號，明恢63及Tadukan的基因組DNA為模板，利用長片段PCR技術(Long-PCR)擴增候選基因片段。PCR程序如下:95°C預變性5分鐘，95°C變性30秒，60°C復性45秒，68°C延伸6分鐘，共35個循環，隨后72°C保溫10分鐘，最后10°C恒溫。隨后對PCR產物進行割膠純化，并電泳檢測。
[0057]3、雙功能基礎載體的準備:將稀有酶切位點AscI導入雙功能載體pCAMBIA1300的多克隆位點BamHI和SalI之間，取代酶切位點XbaI，構成基礎載體pCAMBIA1300-AscI。
[0058]4、候選抗性基因與基礎載體的連接:用限制性內切酶AscI，同時酶切PCR產物與基礎載體質粒，并純化。在T4連接酶的作用下，將候選基因片段連入基礎載體pCAMBIA1300-AscI，通過菌落PCR，挑取陽性單克隆，搖菌提取質粒，測序，檢測。由此我們一共成功克隆了 101個基因。
[0059]5、候選抗性基因的遺傳轉化:將攜有候選基因的雙功能載體導入根癌農桿菌EHA105，采用農桿菌介導法，將候選基因轉化到水稻普感品種新2號和TP309中。最后一共獲得180株獨立的轉化體。
[0060]6、PCR分子檢測:以轉化體DNA為模板，用潮霉素抗性基因及其上游CaMV35S啟動子的特異性引物對其進行PCR反應。潮霉素抗性基因的引物序列見序列表SEQ ID NO: 109和SEQ ID N0:110oCaMV35S啟動子的引物序列見序列表SEQ ID NO: 111和SEQ ID NO: 112。
[0061]7、轉化體的抗性鑒定:選擇12個來源地不同，區別力好的獨立稻瘟病菌生理小種作為檢測的病原菌種。利用稻瘟病菌小種接種感染T2代轉基因植株和對照品種，篩選抗病性改變的轉化體。最后一共鑒定獲得了 33個具有抗性的株系，18個具有抗性的新基因(RMgl9-RMg36)。
[0062]8、抗稻瘟病基因蛋白結構分析:采用步移法對抗病基因的DNA序列進行了測序。所述18個具有抗性的新基因RMgl9-RMg36的DNA序列分別如SEQ ID NO: 10-27所示，其編碼的蛋白質分別如SEQ ID N0:37-54所示。
【權利要求】
1.高通量克隆植物抗病基因的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)借助抗病基因遺傳進化規律和生物信息學手段，挑選候選抗病基因:使用生物信息學方法，找出靶標植物基因組或其近緣物種基因組中所有的NBS-LRR類型抗病基因；構建系統發育樹、劃分基因家族，并分析基因簇在染色體上的分布；根據已知功能的抗病基因在系統進化枝上的分布，選取位于已知功能抗病基因枝及鄰近枝基因作為候選的抗病基因；以及根據系統進化枝的聚類情況及基因家族分布，選取在同一基因組內存在多拷貝，且拷貝之間蛋白的相似度>70%的基因家族作為候選的抗病基因； 其中所述的靶標植物可以是水稻、玉米、高粱、小麥、大麥、大豆、棉麻、西紅柿、馬鈴薯、煙草，也可以是葡萄、蘋果、桔子、楊樹等水果或林木；選取的病害是真菌、細菌、病毒或線蟲引起的、可被植物抗病基因識別并產生抗病反應的病害； (2)挑選合適的植物抗病品種作為基因克隆的材料，該材料可以是同一物種內具有抗性的品種或生態型，也可以是這一物種相關的近緣物種； (3)用長片段PCR技術的方法克隆經過挑選的候選基因，通過測序檢測基因的完整性；將這些基因構建到雙功能載體中； (4)選擇高感且易于轉基因品種、或具有優良農藝性狀但感病的品種作為受體，用農桿菌介導或其它轉基因的方法，將候選基因轉如其中；以及 (5)利用植物特定的病原菌株接種感染，篩選鑒定轉基因的植株個體，鑒定候選抗病基因功能。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于挑選抗病的植物品種或其近緣物種作為基因克隆的材料。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于挑選高感的植物品種作為轉基因受體材料。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其中所述靶標植物為水稻，所述病害為稻瘟病，克隆供體材料為水稻Tet印、谷梅2號、谷梅4號、明恢63及野生稻及近緣物種玉米、高粱、短柄草。
5.根據權利要求4所述的的方法，其中選取易感稻瘟病的材料作為轉基因受體材料，所述易感稻瘟病的材料包括水稻品種麗江新團黑谷、C039、新2號、臺北309和蘇御糯。
6.根據權利要求1-5任一項所述的方法，其特征在于在所述步驟(1)中進一步篩選候選基因，要求基因編碼區長度大于2000bp，基因全長小于20000 bp，并使用常規軟件對其作啟動子和終止子預測。
7.稻瘟病抗性基因，其DNA序列分別如SEQID NO: 1- SEQ ID NO:27中的任一個所示。
8.含有根據權利要求7所述的稻瘟病抗性基因的載體。
9.根據權利要求8所述的載體用于轉化水稻從而制備轉基因抗稻瘟病水稻的用途。
10.根據權利要求7所述的稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白，其氨基酸序列分別如SEQID NO:28- SEQ ID NO:54 中的任一個所示。
11.根據權利要求10所述的抗稻瘟病基因所編碼的蛋白在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
【文檔編號】A01N47/44GK103805595SQ201210453400
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月13日 優先權日:2012年11月13日
【發明者】田大成, 楊四海, 張小輝, 王嬌, 譚生軍, 仲巖 申請人:南京大學