專利名稱：枯草芽孢桿菌has及其在防治甘蔗黑穗病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物技術領域，涉及一株菌株及其應用，具體是一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS及其在防治甘鹿黑穗病中的應用。
背景技術：
甘蔗黑穗病最早是在1877年南非納塔爾被發現，隨后在其它國家、地區也相繼有該病害發生的報道。中國于1932年在廣州發現該病害，之后各地也都出現該病。近年來，隨著蔗種無性繁殖栽培技術的推廣，蔗種頻繁引進調運，蔗田長期連作同一品種以及宿根 蔗年限的逐漸延長，造成甘蔗黑穗病在我國廣西、云南、廣東、福建、海南等省蔗區發生日趨嚴重，造成的損失多達10-30%，嚴重的甚至導致宿根蔗幾乎絕收。甘鹿黑穗病是由Ustilago scitaminea Sydow.(屬擔子菌綱黑粉菌屬)引起的一種真菌病害，該病菌營養菌絲無色，具分隔分枝功能，在甘蔗的分生組織細胞中生長，菌絲成熟后，形成厚膜孢子堆(冬孢子)。甘蔗黑穗病最明顯特征是病蔗梢頭具一條向下卷內的黑色鞭狀物，長幾厘米至數十厘米不等，鞭中央是由薄壁組織或維管束組織構成的心柱，夕卜圍包著一層厚垣孢子。染病蔗株的黑穗長短因品種而異，短為幾厘米，直或彎曲，長至幾十厘米，向下彎曲成圈，有些品種可達I米多。在適宜的環境條件下，感染蔗株在病菌侵染2-4個月開始形成黑穗，在病菌侵染6-7個月黑穗長度可達到頂峰。甘蔗黑穗病危害嚴重，但對其的防治效果不理想。目前，控制甘蔗黑穗病的措施主要有抗病品種、輪作、人工拔除發病蔗株、溫水處理種蔗及種苗消毒等。生產上栽培的甘蔗品種抗病性較差，有限的抗性基因材料也相當缺乏，而且該病菌致病性存在分化，即有生理小種分化，致使同一抗病品種在一地抗病，在另一地抗性較差。有效的防治措施——輪作卻因為對于甘蔗這一作物卻難以實施，一是甘蔗種植一般為新植一年，宿根2年或更長，二是甘蔗主要在我國南部熱帶、亞熱帶地區生長，多栽種在山地、坡地和旱地，適宜輪作的作物范圍有限，因此，輪作很難被完全采用。常用的化學防治(種苗消毒)對新植蔗有一定的防治效果，但隨著甘蔗宿根時間的延長，病害的發生越來越嚴重。生物防治因對環境友好和易于使用而在其它作物病害上已部分地發揮作用，但用于甘蔗黑穗病病害的防治一直停滯不前。國內外也有利用微生物對甘蔗黑穗病菌孢子進行防治的報道。國外，Sinha 和 Singh 報道四種真菌(Fusarium moniliforme [Gibberellafujikuroi] var. subglutinans, Aspergillus niger, A. flavus and Penicillium sp.)具有對甘蔗黑穗病的黑鞭的產生和對冬孢子萌發的抑制作用。國內，廣西大學廖詠梅等采集甘蔗苗期、生長期的甘蔗土壤、健株及病株的種蔗、葉、莖、芽、根和土壤中分離篩選到一些對黑穗病菌有抑制作用的菌株，并利用相關基因序列設計特異性引物，探討得到相關抑制因子的基因。但未見用生物防治措施有效控制黑穗病的系統報道。經檢索，尚未見到利用微生物及其生防制劑成功用于防治甘蔗黑穗病的報導
發明內容
本發明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的應用。一株枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號；保藏編號CGMCC NO. 6590。本發明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS菌株，分離自我國海南省蔗區的甘蔗根際土壤，經形態學、培養性狀、常規生理生化和16S rDNA序列鑒定，該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的一個新菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) HAS。本發明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS的基本生物學特性為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9X I. 8 2. 4μ m之間，產生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。在LB培養基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。·
本發明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的應用。以本發明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS為活性成分的生物制劑也屬本發明的保護范圍。需要的時候，該制劑可以包含生物制劑制備的常用載體和輔料。本發明通過盆栽試驗的方法研究枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對黑穗病菌孢子的抗性，實驗結果表明枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS對甘蔗黑穗病的發生有很好的抑制作用，通過浸種，其防效可達100%。表明該菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株。本發明通過對蔗區甘蔗根際土壤中微生物的篩選分離，獲得枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS，經過盆栽試驗表明該菌株對甘蔗黑穗病的發生有很好的抑制作用，可以有效地控制甘蔗黑穗病的發生，減少損失，是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株，為我國甘蔗產業的發展提供幫助。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一、植物病原真菌拮抗菌的篩選及其鑒定菌株篩選稱取5克根際土壤(我國海南省臨高縣甘蔗黑穗病發生嚴重的地塊中甘蔗植株的根際土壤)，放入有IOOml無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后，靜置15min。取Iml稀釋至10_4、10_5、10_6濃度梯度，從各濃度梯度懸浮液中取O. 1ml，用無菌涂棒涂于LB培養基(配方為每升含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，瓊脂粉12g，pH7.0 7. 2)平板上，30°C恒溫培養箱倒置培養，連續觀察3天，挑取菌落形態不同的菌株再次劃線純化保存備用。在倒好的PDA平板表面涂布甘蔗黑穗病菌冬孢子，在超凈工作臺內晾干后，用無菌牙簽點接篩選純化后的菌株進行對峙培養，篩選抑菌作用最強(抑菌活性最強)的菌株，結果得到一株對甘蔗黑穗病菌有很強拮抗作用的菌株，將該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS。已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號=CGMCC No. 6590。菌株的基本生物學特性革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約O. 7 O. 9 X I. 8 2.4 μ m之間，產生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。在LB培養基上初期菌落淺白色，圓形，表面濕潤，膿狀，難挑起；后期菌落淡黃色，邊緣不整，表面褶皺，挑起褶皺帶起膿狀絲。菌株16S rDNA保守序列的測定將篩選得到的菌株(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) HAS)的基因組DNA為模板，以細菌16S rDNA序列通用引物PQ、P6作為引物，PCR擴增出約I. 5kb左右的產物片段，測序結果表明擴增出的序列長度為1518個堿基；將該序列通過互聯網比對(http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi),擴增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達99%以上，確定該菌株歸屬為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)。實施例二、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對甘蔗盆栽苗黑穗病防效的測定以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS為菌種培養得到生物制劑(以下為重量百分比)I、固體培養將處于保藏狀態的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS接種于固體培養基(1%胰蛋白胨，O. 5%酵母萃取物，l%NaCl, I. 2%瓊脂粉，pH7. O.)中，于37°C培養箱中培養I天，使菌株活化。2、液體培養將活化的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS接種于裝有液體培養基(黃豆粉 2. 0%,玉米粉 I. 0%,蔗糖 O. 5%,蛋白胨 O. 3%, CaCO3 O. 2%, (NH4) 2S04 O. 05%,MgSO4- 7H20 O. 02%, KH2PO4 O. 1%, NaOH O. 05%，花生油 O. 2%,消泡劑 O. 02%, ρΗ6· 8-7. 2.)的500ml三角瓶中，每瓶裝200ml，在37°C下，轉速170rpm的搖床上培養36h，得到液態生物制齊IJ (生防菌液一)。或將上述培養液接至發酵罐中進行發酵生產，獲得液態生物制劑(生防菌液二 )。盆栽甘蔗黑穗病防效試驗利用遠離甘蔗田的土壤拌入采集到的黑穗病菌孢子，使土壤含菌量達到107克，然后裝入塑料盆(上直徑30cm，下直徑20cm，高30cm)。種莖來自健康種苗基地，經PCR抽樣檢測沒有檢測到含有黑穗病菌。試驗設4個處理，4次重復，每重復5盆，每個盆內植入單芽種莖4段。處理I用生防菌液一稀釋10倍液浸泡種莖10分鐘，處理2用生防菌液二稀釋100倍液浸泡種莖10分鐘，處理3用生防菌液一稀釋500倍液浸泡10分鐘，處理4為對照，用清水浸泡種莖10分鐘，之后分別植入上述塑料盆中，澆入清水后進行試驗，其后所有管理一樣。一個月后統計出苗情況，6個月時統計各處理重復的發病株數(以抽出可以觀察到黑穗鞭為準)，計算發病率及防治效果，結果見表I。發病率(％)=發病總株數/出苗總株數X 100防治效果(％)=(對照組發病率-處理組發病率)/對照組發病率X 100表一枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS對甘蔗盆栽苗黑穗病的防治效果
權利要求
1.一株枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNO. 6590。
2.權利要求I所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HAS在防治甘蔗黑穗病中的應用。
3.一種防治甘蔗黑穗病的生物制劑，其活性成分為權利要求I所述的保藏編號為CGMCC NO. 6590 的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HAS。
全文摘要
本發明涉及一株枯草芽孢桿菌HAS及其在防治甘蔗黑穗病中的應用，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS，已于2012年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC NO.6590。本發明所提供的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS的用途是其在防治甘蔗黑穗病中的應用，盆栽試驗表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HAS對甘蔗黑穗病的發生有很好的抑制作用，通過浸種，其防效可達100%，表明該菌株是一株在防治甘蔗黑穗病菌上具有潛在意義的生防菌株。
文檔編號A01P3/00GK102899280SQ20121045270
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月14日 優先權日2012年11月14日
發明者熊國如, 伍蘇然, 張樹珍, 楊本鵬, 馮翠蓮, 蔡文偉, 王俊剛, 王文治 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所