專利名稱：以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因育種方法
以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因育種方法技術領域
本發明屬于農業育種領域，具體而言，涉及一種以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因玉米育種方法。
背景技術：
轉基因育種已經成為現代分子育種的一種重要手段。從80年代后期科學家開始進行玉米轉基因研究，至今已經取得一些重要成果。國外已經有部分商業化種植的玉米轉基因品種，例如高賴氨酸轉基因玉米，抗玉米螟轉基因玉米，抗除草劑轉基因玉米等。而國內成功的例子還相對較少，轉基因育種進程遠遠落后于美國等發達國家。在玉米轉基因領域常用的遺傳轉化方法是以幼胚和幼胚誘導的胚性愈傷組織為受體的農桿菌介導法。此類方法的特點是受體為二倍體的玉米材料，且須經歷幼胚脫分化和再分化等復雜的組織培養過程。存在以下缺點(I)不同基因型玉米幼胚的脫分化和再分化能力具有很大差異，很多生產上使用的骨干自交系由于甚至不能誘導出胚性愈傷組織，或者再分化效率極低，而不能作為轉化受體，這限制了轉基因玉米受體基因型的選擇范圍；(2)基因轉化效率低，如果沒有龐大的受體系統難以獲得足夠的轉化事件，篩選出目的基因高效表達的轉化體幾率非常小；(3)目的基因遺傳不穩定，基因沉默和基因丟失現象比較常見，難以獲得目標性狀穩定的轉基因株系；(4)以二倍體玉米作為受體材料獲得的當代轉基因植株其目的基因在同源染色體上處于雜合狀態，必須經過2代以上的自交才能獲得純合穩定的轉基因株系，導致獲得轉基因純合的株系周期太長。
近年來也開展了以植物單配體為受體系統的轉基因研究。在煙草和大麥的上，以雌雄配子體及其培養形成的單倍體愈傷組織為受體已成功獲得了陽性轉化事件；利用組織培養技術進行花粉和卵細胞的單倍體培養，誘導出胚性細胞或愈傷組織，進一步分化發育成單倍體植株，建立單倍體轉基因受體系統。該技術在水稻和煙草上也有成功應用的報道。
無論以花粉、卵細胞等雌雄配子體作為受體的轉基因技術都必須經歷愈傷組織誘導和分化等組培過程，而單倍體的組培系統尚不成熟，培養再生植株非常困難，直接影響了陽性轉化事件的獲得；同時，在單倍體誘導愈傷組織的整個過程歷時長，容易發生自然加倍現象，導致單倍體受體本身產生效率低；另外，此類技術的取材時間只能局限在植物生殖生長期，受到嚴重的季節限制。發明內容
本發明針對以上存在問題，建立了單倍體玉米莖尖生長點直接分化受體系統，用農桿菌介導法將目的基因導入受體，再將陽性轉基因植株進行加倍獲得轉基因二倍體玉米的方法。
為了實現本發明的目的，本發明擬采用如下技術方案
本發明一方面涉及一種以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因育種方法，包括如下步驟
(I)用單倍體誘導系stock6做為父本，以西南地區玉米骨干自交系18-599作為母本，進行雜交組配并收獲Fl代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；
(2)對獲得的單倍體種子進行消毒，然后在培養箱中進行黑暗條件下培養，待胚芽生長到2 4cm
(3)以含目的基因的表達載體制備含目的基因表達載體的轉化農桿菌,篩選轉化的農桿菌并制備成侵染液；
(4)切單倍體莖尖在超凈工作臺上墊上提前滅過菌的濾紙，然后從培養基上用鑷子取出步驟(2)中待轉化的發芽植株，用手術刀先切去種子胚根，在莖節鼓起處以上I毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝去胚芽鞘露出莖尖生長點，再從中部縱向切傷莖尖生長點， 傷口深度約Imm;
(5)農桿菌侵染莖尖擺放好莖尖的培養皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農桿菌侵染液滴加在培養皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30-70kPa壓力下侵染6-12min ；
(6)共培養侵染結束后，用吸管快速吸凈培養皿上多余的菌液，置于21 25°C繼續暗培養4 6天,直至長出新葉,且節根長至I 2cm ；
(7)共培養結束后，將長出新葉的轉化苗用室溫下的自來水洗掉表面的培養基和菌體，然后將其整齊的移栽到土壤中，先置于人工氣候室避光生長2 3d，然后讓植株在日溫22 28°C、夜溫15 21 °C的條件下生長，直至植株3葉I心期；
(8)陽性單倍體植株的加倍處理待步驟(7)中的陽性單倍體植株和對照植株生長至四葉一心期時，用除草劑進行加倍，具體方法為將二甲基亞砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至單倍體植株的心葉處，每株約O. 5-1. 5ml，重復2-4次；
(9)陽性純合轉基因二倍體種子的獲得
加倍處理后，待植株長至5葉期將其移栽到溫室或大田，花期能正常散粉的均為加倍成功的陽性植株，將它們進行套袋自交，收獲的種子即為純合的轉基因二倍體種子。
在本發明的一個優選實施方式中，所述步驟(2)中的消毒過程包括如下步驟將篩選得到的紫頂白胚的單倍體種子，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒8分鐘、O. 1%氯化汞水溶液滅菌6分鐘、無菌水洗滌3次；然后加I. 5倍種子體積無菌水在24 26°C浸泡6小時；再用O. I %氯化汞水溶液滅菌10分鐘、無菌水洗滌5次。
在本發明的一個優選實施方式中，培養所使用的培養基為改良的MS培養基，改良的MS培養基配方如下表所示
權利要求
1.以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因育種方法，包括如下步驟(1)用單倍體誘導系stock6做為父本，以西南地區玉米骨干自交系18-599作為母本， 進行雜交組配并收獲Fl代雜交種，從獲得的種子中挑選胚乳頂部為紫色而胚為白色的種子，該種子大部分為單倍體；棄去胚乳頂部和胚均為紫色的二倍體種子；(2)對獲得的單倍體種子進行消毒，然后在培養箱中進行黑暗條件下培養，待胚芽生長到2 4cm (3)以含目的基因的表達載體制備含目的基因表達載體的轉化農桿菌，篩選轉化的農桿菌并制備成侵染液；(4)切單倍體莖尖在超凈工作臺上墊上提前滅過菌的濾紙，然后從培養基上用鑷子取出步驟(2)中待轉化的發芽植株，用手術刀先切去種子胚根，在莖節鼓起處以上I毫米左右的部分橫向微切，輕輕剝去胚芽鞘露出莖尖生長點，再從中部縱向切傷莖尖生長點，傷口深度約Imm ；(5)農桿菌侵染莖尖擺放好莖尖的培養皿置于真空干燥器中，并墊上泡沫塑料使其向莖尖一邊傾斜，然后農桿菌侵染液滴加在培養皿中莖尖一方，使莖尖能完全接觸菌液，完全蓋上真空干燥器蓋子，在30-70kPa壓力下侵染6 12min ；(6)共培養侵染結束后，用吸管快速吸凈培養皿上多余的菌液，置于21 25°C繼續暗培養4 6天,直至長出新葉,且節根長至I 2cm ；(7)共培養結束后，將長出新葉的轉化苗用室溫下的自來水洗掉表面的培養基和菌體，然后將其整齊的移栽到土壤中，先置于人工氣候室避光生長2 3d，然后讓植株在日溫 22 28°C、夜溫15 21°C的條件下生長，直至植株3葉I心期；任選的，包括根尖鏡檢篩選陽性單倍體步驟；(8)陽性單倍體植株的加倍處理待步驟(7)中的陽性單倍體植株和對照植株生長至四葉一心期時，用除草劑進行加倍，具體方法為將二甲基亞砜溶解甲基胺草磷溶液用滴管滴至單倍體植株的心葉處，每株約O. 5-1. 5ml，重復2-4次；(9)陽性純合轉基因二倍體種子的獲得加倍處理后，待植株長至5葉期將其移栽到溫室或大田，花期能正常散粉的均為加倍成功的陽性植株，將它們進行套袋自交，收獲的種子即為純合的轉基因二倍體種子。
2.根據權利要求I所述的育種方法，其特征在于所述步驟(2)中的消毒過程包括如下步驟將篩選得到的紫頂白胚的單倍體種子，在超凈工作臺上用75%乙醇消毒8分鐘、 O. I %氯化汞水溶液滅菌6分鐘、無菌水洗滌3次；然后加I. 5倍種子體積無菌水在24 26°C浸泡6小時；再用O. I %氯化汞水溶液滅菌10分 鐘、無菌水洗滌5次。
3.根據權利要求I所述的育種方法，其特征在于培養所使用的培養基為改良的MS培養基，改良的MS培養基配方如下表所示
4.根據權利要求I所述的轉基因育種方法，其特征在于所述的載體為以含目的基因 Incw2 的表達載體 3300-27KD-Incw2-ba。
5.根據權利要求I所述的轉基因育種方法，其特征在于所屬的侵染液的制備包括如下步驟挑取農桿菌陽性單克隆置于含Kan和Rif的YEP液體培養基中于25_30°C避光振蕩培養10-15h，使細菌處于對數生長期，離心收集菌體，將菌體用等體積的添加100 μ mo/LAS 的浸染培養基重懸。
全文摘要
本發明公開了以單倍體玉米莖尖為受體的轉基因育種方法，其包括1.單倍體材料的獲得及前處理；2.單倍體材料的培養；3.目的基因轉化單倍體莖尖；4.轉化苗的移栽和加倍處理。本發明的方法避免了玉米組織培養及再生過程，適用于大多數基因型玉米的遺傳轉化；以單倍體玉米莖尖為轉基因受體的遺傳轉化技術是簡易高效、省時省力、廣泛適用的一種快速獲得轉基因玉米純合體的新方法。
文檔編號A01H4/00GK102934607SQ20121044814
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月12日 優先權日2012年11月12日
發明者沈亞歐, 潘光堂, 江舟, 楊珊, 林海建, 彭煥偉, 張志明, 羅旭, 馬浪浪, 李婉蓉, 張兵 申請人:四川農業大學