專利名稱：一種通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法。
背景技術：
轉基因植物是指采用基因工程手段將從不同生物中分離或人工合成的外源基因在體外進行酶切和連接，構成重組DNA分子，通過微生物介導、人工原生質體、顯微注射以及基因槍轟擊等方法，直接導入到植物體細胞內或組織中，使新的基因在植物細胞或組織內整合、表達，并能通過無性或有性增值過程，將外源基因遺傳給后代，由此獲得基因改良植物，使之穩定遺傳并賦予植物新的農藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等。這一技術克服了植物有性雜交的限制，使基因交流的范圍無限擴大，可將從細菌、病毒、動物、遠緣植物、人類甚至人工合成的基因導入植物，所以其應用前景十分廣闊(Twyman，2003 ； ffalmsley,2000)。轉基因植物技術及其產品是當今世界農業生物技術研究與產業化開發的重點和熱點，是我國農業科技革命的核心內容之一，對我國農業科技手段的更新換代以及農業產業結構的調整具有重要的戰略意義。隨著現代生物技術的迅速發展，植物轉基因技術方興未艾，因而對它的研究意義也顯得尤為重要。1986年Fromm等(1986)利用電擊法首次將抗除草劑pat基因轉入玉米原生質體中，獲得了穩定整合和表達的愈傷組織，實現了玉米遺傳轉化的重大突破，但是沒有獲得轉化植株。1988年Rhodes等(1988)首次獲得玉米轉基因完整植株，隨后Prioli等(1989)、Shillito等(1989)、Fromm等(1990)分別于1989年和1990年報道獲得了可育的玉米轉化植株。到目前為止，世界轉基因玉米研究已經從轉化方法的探索發展到商品化階段。在短短20年的時間里，玉米轉化受體、轉化方法以及目的基因應用等各方面的研究都取得了迅速發展。玉米遺傳轉化的方法按其是否需要通過組織培養、再生植株可分成兩大類，第一類需要通過組織培養再生植株，常用的方法有農桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。農桿菌介導的遺傳轉化過程主要包括5個步驟(顧紅雅，1997) (I)細菌在植物敏感細胞上吸附；(2)農桿菌中Ti質粒的vir區被激活；(3) T-DNA的切割和T-DNA復合物的形成；(4)T-DNA復合物由農桿菌進入植物細胞；(5)T-DNA整合到染色體上并進行表達。選擇和建立良好的植物受體系統是基因轉化能否成功的關鍵因素之一。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其它非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。目前用于玉米基因轉化的受體系統主要有以下幾種(I)胚性愈傷組織1949年LaRue (1949)用甜玉米的胚乳作外植體首次誘導出愈傷組織，但最終未獲得再生植株。直到Green等(1975)用A188的幼胚作外植體，誘導出二倍體愈傷組織，并獲得再生植株，從此，玉米組織培養技術不斷完善。愈傷組織由外植體誘導形成，有兩種類型，大多數玉米自交系易形成致密的I型愈傷組織，這種愈傷組織胚性差，繼代后較難再生出植株；另一種松脆的II型愈傷組織生長迅速，可以長期繼代保持胚性，便于產生胚性懸浮細胞系，繼而制備原生質體，雖然玉米II型愈傷組織的誘導受到基因型的影響，但其仍是目前玉米轉化的常用受體，具有較高的轉化頻率和再生頻率。愈傷組織多是以幼胚作外植體誘導產生而來，比較容易獲得，再生能力較強，獲得轉化植株的周期相對較短，仍然是目前應用最廣泛的受體材料。Huang等(2004)利用成熟胚建立高效的再生體系時也在成熟胚中獲得了較高的胚性愈傷組織發生率，因此對便于操作的成熟胚進行研究，誘導胚性愈傷組織可能有會建立理想的轉化受體系統。由于胚性愈傷組織再生能力較強，容易大量繁殖，獲得轉化植株的周期較短，是目前應用最廣泛的受體材料之一。但是，從外植體誘導的愈傷組織常是由多細胞形成，本身就是嵌合體，因而分化的不定芽嵌合體比例更高，這就使篩選轉基因再生植株的難度加大。再者，愈傷組織所形成的再生植株無性系變異較大，轉化的外源基因遺傳穩定性較差，為了克服這種困難，有人提出幾種方法，如借助非轉化正常植株的花粉授粉、延長生長過程、使其 盡量減少變異等。⑵幼胚玉米幼胚具有較強的生活狀態，也是進行遺傳轉化很好的受體材料。未成熟胚的盾片再生植株的能力很強，玉米幼胚可通過短時間的愈傷化而不經過愈傷組織階段即可直接再生植株，其中長度在I. 0-2. Omm的玉米幼胚是用農桿菌介導轉化的最佳尺寸網。玉米的基因型、幼胚的大小及植株的發育狀態是影響玉米幼胚培養植株再生的重要因素，其中基因型影響尤為突出，這就需要大量篩選玉米品種，找出最適合轉基因的基因型。自從1996年Ishida等(1996)首次用農桿菌轉化玉米自交系A188的幼胚，獲得了轉基因植株以來，幼胚轉化體系已被廣泛應用于國內外玉米轉基因工作中。Zhao等(2002)在農桿菌介導玉米幼胚轉化的過程中，對轉化條件和培養基成分進行了優化，幼胚轉化率達到32. 8%。吳敏生(2001)，Lozvaya(2006)，趙云云(2006)等針對不同基因型玉米幼胚的組織培養體系進行研究為玉米轉基因技術提供了高效穩定的轉化受體系統。(3)莖尖分生組織莖尖分生組織培養始于上世紀40年代，是植物組織培養中的常規技術。用莖尖分生組織作轉化受體，具有基因型依賴性較小、遺傳較穩定、分化成苗率較高、且取材不受季節限制等優點，能夠克服我國目前生產上常用的玉米自交系存在的胚性愈傷組織誘導頻率不高、胚性愈傷組織繼代過程中胚性易喪失、再生植株中出現大量體細胞無性系變異等問題，是一種很有發展前景的遺傳轉化受體系統。Gould等(1991)用gus報告基因和Npt基因通過農桿菌介導法轉化玉米Funk G90的芽尖，得到的再生植株及其子一代基因組中帶有標記基因，為建立玉米高效遺傳轉化體系奠定了基礎。Low等(1995)以玉米莖尖分生組織為受體，把DNA轉移到早期合子胚的分生組織中，直接分化再生系統省去了愈傷誘導培養過程，體細胞無性變異小，獲得再生株的周期短，但玉米莖尖的培養困難。李國圣等(2000)以玉米優良自交系為材料，用芽尖分生組織誘導出胚狀體和叢生芽，建立起一種快速有效的玉米叢生芽誘導與遺傳轉化體系，并用基因槍將抗除草劑als基因轉入玉米細胞，獲得轉基因再生植株。Sairam等(2003)報道了一個快速高效的農桿菌轉化的體系，不經過誘導愈傷階段，直接用農桿菌轉化玉米莖尖，也獲得了轉基因再生植株。直接再生分化系統省去了愈傷誘導培養過程，體細胞無性變異小，獲得再生植株的周期短。Sidorov等(2006)用玉米莖尖誘導出愈傷組織，再用農桿菌轉化愈傷組織，獲得了可以遺傳的轉基因玉米。但是玉米莖尖起源于多細胞，所形成的再生植株嵌合體多，這是該受體系統的一大缺點。玉米未成熟胚培養獲得的胚性愈傷組織具有良好的繼代能力和再生植株能力，但其受地理條件、生長季節、發育階段以及基因型的嚴重影響，削弱了實用性，不便于研究工作的進展。以玉米成熟胚為外植體誘導的愈傷組織作為遺傳轉化受體，獲取植株的周期短、取材方便、不受生長季節限制、滅菌容易、外植體均勻、重復性好、再生植株頻率高，是一種比較理想的適合于玉米遺傳轉化的再生體系。這不僅可以對玉米的遺傳研究工作帶來方便，而且對轉基因研究和其他生物學研究以及拓寬在雜交育種中的應用奠定基礎。建立玉米芽尖培養體系和遺傳轉化體系將是玉米轉基因研究的一大熱點。(4)原生質體植物原生質體是除去細胞壁后的“裸露”細胞，具有全能性，能在適宜的條件下再 生出植株。由于去除了細胞壁的障礙，人們利用物理或化學方法(電激法、PEG法、顯微注射法等)，使外源DNA能有效地通過植物裸露的原生質體膜，整合到細胞染色體上，實現基因的遺傳轉化。原生質體作為受體材料，外源DNA能較容易地進入，培養出來的細胞，常分裂形成基因型一致的細胞克隆，因此得到的轉基因植株嵌合體少。Fromm等(1986) ,Rhodes等(1988)，Prioli (1959)分別成功地以玉米的原生質體為受體，對玉米進行遺傳轉化。原生質體作為受體進行轉化，方便易行，轉化效率比較高。但是，其中也存在一些問題(I)原生質體培養技術難度大，周期長，植株再生困難；(2)原生質體培養形成的細胞無性系變異強烈，遺傳穩定性差；(3)原生質體再生植株自交結實困難。這些因素限制了玉米原生質體在基因工程中的廣泛應用和發展。近幾年來，隨著其它受體系統的發展，原生質體已經很少被使用。(5)種質受體種質受體指轉基因利用的受體是植物自身的生殖系統，如花粉粒、卵細胞，也稱生殖細胞受體系統。現已建立了多種直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉化的方法，如花粉管通道法。利用種質系統進行轉化可以簡化遺傳轉化過程，避開了組織培養，縮短了實驗周期；生殖細胞接受外源遺傳物質的能力比較強，導入外源基因的成功率高，更易獲得轉基因植株生殖細胞是單倍體細胞，轉化的基因無顯隱性影響，能使外源基因充分表達，加速純合體的獲得。但是，這種受體系統也有不利之處，例如轉化后代群體較大，需要有簡便、可靠的篩選方法；利用植物自身生殖細胞進行遺傳操作只能在短暫的開花期內進行受到季節的限制。除了上述轉基因受體材料，近年來，科學家建立了許多以作物種子為起始材料的轉基因體系。例如，從水稻、黑小麥種子中的成熟胚或盾片誘導胚性愈傷，這種愈傷可以通過基因槍或農桿菌介導的方法進行轉化。此外，以萌發的大麥、燕麥、小麥、谷子、肯塔基六月草和蘭花草種子為起始材料誘導胚性愈傷，而藍格蘭馬草、高粱和小麥從幼苗上分離的莖段可以用于誘導分生組織。科學家建立了高效的玉米種子誘導的莖分生組織的體系，以該莖尖分生組織為外植體，科學家成功地建立了基因槍轉化體系。
發明內容
針對上述缺點，本發明提供一種本發明的目的之一是通過以下技術方案來實現的將消毒過的種子擺放在滅菌的濾紙上，用消毒滅菌的醫用鑷子將消毒過的玉米種子轉移到萌發培養基上，靠近胚乳一側朝下，靠近胚的一側朝上；將擺放好種子的培養皿置于光照培養箱中，光強80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，27-28°C下培養7d。選取萌發較好的幼苗用于頂端分生組織(幼苗節點區域)愈傷誘導，在無菌的50ml的離心管中，用鑷子小心加入繼代7d左右、生長良好的胚性愈傷組織，加入含乙酰丁香酮的侵染培養基，黑暗中放置lh。緩慢吸去侵染培養基，加入適量的上述制備好的農桿菌菌液(以至少浸過愈傷組織為宜)，蓋上離心管蓋，輕輕上下顛倒lmin，黑暗處放置lOmin。用Iml移液器小心吸去菌液，將侵染過的愈傷組織轉移到滅過菌的5層濾紙上。待愈傷上的菌液被完全 吸凈后，將侵染后的愈傷轉移到共培養培養基上，培養基用封口膜封口后于25°C、黑暗條件下共培養3d,共培養3d后的愈傷組織,依次用含有250mg/l噻孢霉素的無菌蒸懼水、無菌蒸懼水洗滌2次，用無菌的濾紙吸凈培養基上殘留的水分，轉入到恢復培養基上，封口后于25°C、黑暗條件下恢復培養7d。侵染后的愈傷在恢復培養基上培養7d后，轉移到篩選培養基上(培養基配方見附表I)，每10個愈傷放置于I個篩選培養基中在28°c、黑暗條件下培養，每14d為I個篩選周期，更換一次篩選培養基，其中AgN03(100yM)間隔添加。篩選期間，對于愈傷變褐的部分要及時切除，篩選結束后，剔除嚴重水潰化、發黑、發褐的愈傷組織，將抗性愈傷組織轉移到篩后恢復培養基上，在28°C、黑暗條件下培養14d。將恢復14d的所有抗性愈傷組織轉移到篩后誘導培養基，在28°C、黑暗條件下培養14d。進行抗性愈傷分化、轉化苗生根培養、轉化苗移栽。
下面結合附圖對本發明的具體實施例作進一步詳細的說明。圖I.種子消毒裝置圖2.玉米幼苗愈傷再生圖3.玉米幼苗愈傷轉化圖4. PCR 檢測
具體實施例方式以下將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述；應當理解，優選實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護范圍。(I)玉米種子的消毒挑選飽滿、整潔且經過殺菌劑處理的玉米種子，置于500ml三角瓶中，向三角瓶中加入75%乙醇，振蕩浸泡811^11。倒掉酒精，向三角瓶中加入O. 1% HgCl2溶液，振蕩浸泡20min。將三角瓶移至超凈工作臺，倒掉HgC12溶液，用無菌水沖洗6次。在超凈工作臺中，將消毒過的種子擺放在滅菌的濾紙上，使種子上殘留的水分緩慢揮發。或者將消毒過的種子或者在通風櫥中用氯氣消毒裝置進行消毒。在啟普氣體發生器的的錐形瓶(500ml)中，加入200ml未稀釋的次氯酸鈉(6. 15%有效成分)，在錐形瓶上方的球形漏斗中加入4ml濃鹽酸，在氯氣消毒裝置中間的錐形瓶中放入200g飽滿、整潔且殺菌劑處理的玉米種子。緩慢擰開球形漏斗的閥門，使濃鹽酸緩慢滴下，產生氯氣。氯氣消毒30min后，關閉啟普氣體發生器，拆分氯氣消毒裝置，盛放種子的錐形瓶用封口膜封口，放置3h，然后將三角瓶轉移到超凈工作臺中，打開封口膜，使種子表面的殘余氯氣緩慢揮發。(2)玉米種子的萌發在超凈工作臺中，用消毒滅菌的醫用鑷子將消毒過的玉米種子置于轉移到萌發培養基上，每個培養基上均勻擺放10粒玉米種子，靠近胚乳一側朝下，靠近胚的一側朝上；擺放完畢后，用Parafilm M封口膜將培養皿封閉。將擺放好種子的培養皿置于光照培養箱中，光強80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，7-28°C下培養7d。(3)胚性愈傷的誘導與繼代 種子萌發7d后，在超凈工作臺中，選取萌發較好的幼苗用于頂端分生組織愈傷誘導。打開擺放了萌發玉米種子的培養皿，用鑷子將這10個萌發的種子轉移到一個新的、消毒滅菌過的培養皿中；用鑷子固定好萌發的種子，用手術刀片切下頂端分生組織(幼苗節點區域)上、下約5_的切段。將切段沿軸線縱切，切面朝下擺放在愈傷誘導(繼代)培養基上，每個培養基擺放10-20個縱切后的切段，置于人工氣候箱中，在光強80-100 μ E，光周期16h光照/8h黑暗，27-28°C的條件下培養(附圖2B)。培養2 4周后，剝離誘導出的愈傷，在顯微鏡下觀察，挑選胚性愈傷(附圖2C)，并將胚性愈傷置于新鮮的愈傷誘導(繼代)培養基上，28 °C黑暗培養2-3周。將胚性愈傷組織轉移到分化培養基中，用鑷子將每個抗性愈傷夾碎成2 6塊，每個培養基擺放1-5個胚性愈傷。在光強80-100 μ Ε，光周期16h光照/8h黑暗(12h/12h)，28°C的條件下分化培養。各個基因型的受體材料會在4-28d不等的時間分化出綠芽。對于沒有夾碎的愈傷上會分化出多個幼苗，及時用鑷子將這些幼苗分開，并將新分開的幼苗轉移到新的分化培養基上。在分化培養基上，若長出細根，必須及時切去，否則不能分化出更多的小苗。(4)侵染用農桿菌菌液的制備將保存于-80 0C冰箱、攜帶有植物轉化載體的農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens，LBA4404菌株或EHA105菌株)菌液在YEB固體培養基(添加鏈霉素50mg/L ；根據轉化載體上攜帶的抗性基因添加100mg/L卡那霉素或100mg/L氨芐青霉素)上劃線。劃過線的培養基用封口膜(ParafilmM )封口，28°C、黑暗條件下倒置培養2d。將培養農桿菌的平板轉移到4°C冰箱中保存(在4°C冰箱中的保存時間不能超過4d，以避免可能發生的質粒重組)。在侵染愈傷前2d傍晚，挑取單菌落置于裝有25ml YEB液體培養基(添加IOOmg/L對應的各種抗生素)的250ml三角瓶(西安延河)中。三角瓶置于轉速為150rpm的恒溫搖床(Thermo)中、26 °C過夜培養。次日上午，將農桿菌培養物按照I : 5的比例稀釋(取出IOml菌液加入到40ml新鮮的YEB液體培養基中)后按照相同的條件繼續培養。當天傍晚，在將這50ml農桿菌菌液均分到2個50ml離心管中(eppendorf), 3500rpm離心15min。移去上清液，用IOml預侵染培養基(200 μ M乙酰丁香酮，50mg/L對應的各種抗生素)懸浮管底的菌體。用液體預侵染培養基將懸浮菌液濃度稀釋到OD66tl = O. 2。在250ml三角瓶中，用預侵染培養基將稀釋的菌液體積補齊到50ml。三角瓶置于轉速為150rpm的恒溫搖床(Thermo)中、26°C過夜培養。第三天早上(侵染當天)，3500rpm離心15min。移去上清液,用1020ml預侵染培養基(200 μ M乙酰丁香酮)懸浮管底的菌體。并將菌液濃度調至OD66tl = O. 5。(5)農桿菌侵染胚性愈傷在無菌的50ml的離心管中，用鑷子小心加入繼代7d左右、生長良好的胚性愈傷組織(每個離心管大約裝入10ml)，加入含乙酰丁香酮的侵染培養基，黑暗中放置lh。用Iml移液器緩慢吸去侵染培養基，加入適量的上述制備好的農桿菌菌液(以至少浸過愈傷組織為宜)，蓋上離心管蓋,輕輕上下顛倒lmin,黑暗處放置lOmin。用Iml移液器小心吸去菌液， 將侵染過的愈傷組織轉移到滅過菌的5層濾紙上。待愈傷上的菌液被完全吸凈后，將侵染后的愈傷轉移到共培養培養基上，培養基用封口膜封口后于25°C、黑暗條件下共培養3d。(6)侵染后的恢復共培養3d后的愈傷組織，依次用含有250mg/l噻孢霉素的無菌蒸餾水、無菌蒸餾水洗滌2次，用無菌的濾紙吸凈培養基上殘留的水分，轉入到恢復培養基上，封口后于25°C、黑暗條件下恢復培養7d。(7)抗性愈傷的篩選侵染后的愈傷在恢復培養基上培養7d后,轉移到篩選培養基上,每10個愈傷放置于I個篩選培養基中在28°C、黑暗條件下培養，每14d為I個篩選周期，更換一次篩選培養基，其中AgNO3(IOOyM)間隔添加。篩選期間，對于愈傷變褐的部分要及時切除。(8)篩選后恢復、誘導階段篩選結束后，剔除嚴重水潰化、發黑、發褐的愈傷組織，將抗性愈傷組織轉移到篩后恢復培養基上，在28°C、黑暗條件下培養14d。將恢復14d的所有抗性愈傷組織轉移到篩后誘導培養基，在28°C、黑暗條件下培養14d。TO代轉基因植株PCR檢測提取TO代轉基因植株葉片DNA。隨即選取各個植物轉化載體轉化的TO代轉基因植株。用特異性引物對抗性標記基因及目的基因進行PCR擴增。隨機選取p3301ZmERD4轉化的植株80株，提取葉片基因組DNA，用Bar基因特異性引物(BarF/BarR)進行PCR擴增，74株為PCR陽性，擴增出與質粒對照大小的片段(370bp)，而未轉化植株沒有擴增出相應的片段。部分轉化植株PCR結果如附圖4A所示其中，M為DL2000DNA ladder ;泳道I為未轉化植株，泳道2為質粒p3301ZmERD4陽性對照。同樣地，隨機選取pl300ihpZmGW2轉化的植株100株，提取葉片基因組DNA，用Hpt基因特異性引物(Hptll293S/Hptll628A)進行PCR擴增，96株為PCR陽性，擴增出與質粒對照大小的片段(310bp)，而未轉化植株沒有擴增出相應的片段。部分轉化植株PCR結果如附圖4B所示其中，M為DL2000DNA ladder ;泳道I為未轉化植株，泳道2為質粒pl300ihpZmGW2 陽性對照。對所有抗性基因PCR檢測呈陽性的轉化植株，進一步PCR檢測目的基因。
權利要求
1.一種通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法，該方法包括以下步驟 (1)玉米種子的消毒、萌發； (2)胚性愈傷的誘導與繼代； (3)制備侵染用農桿菌菌液并侵染胚性愈傷； (4)侵染后的恢復； (5)抗性愈傷的篩選； (6)篩選后恢復、誘導； (7)抗性愈傷分化； (8)轉化苗生根培養； (9)轉化苗移栽。
2.如權利要求I所述的通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法，其特征在于農桿菌菌液侵染胚性愈傷的過程為取生長良好的胚性愈傷組織，加入含乙酰丁香酮的侵染培養基，黑暗中放置lh，吸去侵染培養基，加入農桿菌菌液，上下顛倒lmin，黑暗處放置lOmin，吸去菌液，將侵染過的愈傷組織轉移到滅過菌的5層濾紙上，待愈傷上的菌液被完全吸凈后，將侵染后的愈傷轉移到共培養培養基上，培養基用封口膜封口后于25°C、黑暗條件下共培養3d。
3.如權利要求I所述的通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法，其特征在于侵染后的恢復過程為把共培養3d后的愈傷組織，依次用含有250mg/l噻孢霉素的無菌蒸餾水、無菌蒸餾水洗滌2次，用無菌的濾紙吸凈培養基上殘留的水分，轉入到恢復培養基上，封口后于25°C、黑暗條件下恢復培養7d。
3.如權利要求I所述的通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法，其特征在于抗性愈傷的篩選過程為侵染后的愈傷在恢復培養基上培養7d后，轉移到篩選培養基上，在28°C、黑暗條件下培養，每14d為I個篩選周期，更換一次篩選培養基，其中AgNO3間隔添加，篩選期間，對于愈傷變褐的部分要及時切除。
4.如權利要求I所述的通過幼苗誘導的愈傷對玉米進行基因轉化的方法，其特征在于篩選后恢復、誘導過程為篩選結束后，剔除嚴重水潰化、發黑、發褐的愈傷組織，將抗性愈傷組織轉移到篩后恢復培養基上，在28°C、黑暗條件下培養14d，將恢復14d的所有抗性愈傷組織轉移到篩后誘導培養基，在28°C、黑暗條件下培養14d。
全文摘要
本發明以玉米種子萌發的幼苗切段為起點，通過種子的消毒與萌發，愈傷的誘導與繼代，愈傷的侵染和共培養，愈傷的抗性篩選和愈傷分化和生根來獲得玉米轉基因植株。本發明可以克服玉米轉基因受體材料生長季節、基因型等的限制，基因轉化效率較高，適宜進行大規模基因轉化事件，具有重要的理論與實際意義。將在玉米轉基因工程中發揮重要的作用，應用前景廣闊。
文檔編號A01H5/00GK102911964SQ20121044169
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月8日 優先權日2012年11月8日
發明者曹言勇, 李會勇, 李晶晶, 王利鋒, 張永輝, 王浩 申請人:河南省農業科學院