專利名稱：利用藻泥生產高效香蕉專用生物有機肥的工藝及產品的制作方法
技術領域：
本發明提供一種利用藻泥生產高效香蕉專用生物有機肥的工藝及產品，屬于農業集約化生產技術，該生物有機肥富含大量促進香蕉生長的香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6,能夠顯著促進香蕉生長。背景技術：
近年來，因資源利用強度加大，我國各大湖泊富集化趨勢嚴重，生態系統退化，藍藻水華頻繁爆發，嚴重影響了人類的生產生活。2007年夏季，太湖、巢湖、滇池接連出現藍藻爆發，洞庭湖、白洋淀等也不同程度地受到富營養化威脅。2008年5月底，太湖爆發了有史以來最為嚴重的藍藻事件，導致無錫居民出現水危機，這一問題引起了社會各界層的廣泛關注。2007年起，大量藍藻被打撈上來，藍藻作為一種富含多種有益物質的生物質資源，其利用值得深入研究。沼化和有機肥是目前藍藻利用研究的最多的兩種處理方法。日本對藍藻資源化利用的措施主要是將藻類作為有機肥料，它的肥效優于一般化肥，氮、磷、鉀含量均高于豆餅、紫云英等植物性有機肥料，藍藻中不含對作物及人體有害的重金屬，使用后不會污染土壤。1992年，日本的脫水微囊藻已全部實現肥料化，年產量120 180t。微囊藻實現資源化利用后，其處理費用下降了 30%。打撈藻泥的含水量在86-89%之間，藻泥干物質全N含量為7. 5-8. 5 %，全P含量為O. 44 %，全K含量為O. 5 % ;有機質含量大于70 %。(I、沈銀武，劉永定，吳國樵，等.富營養化湖泊滇池水華藍藻的機械清除[J].水生生物學報，2004，25 (2) :131-136. 2、藍藻快速好氧堆肥的研究江南大學碩士論文2009第2頁)。因此，資源化利用太湖打撈藻泥變廢為寶，開發成優質有機肥料，不僅有效解決了藍藻易腐敗發臭問題，而且可轉化為農業資源，變“廢”為“寶”。但原料藍藻里面含毒素、蛋白等大分子物質，不經過處理會二次污染環境(氮、磷、藻毒素)，而且養分不能直接被植物所利用(杜靜，《太湖水華藍藻資源化技術研究》D，南京農業大學，2008，碩士學位論文；韓志國，武寶王，鄭解生，等.淡水水體中的藍藻毒素研究進展(綜述KJ].暨南大學學報自然科學版，2001,22(3) :129-134 ;楊海麟，李克朗，張玲，等.藍藻資源無害化利用技術的研究[J].生物技術，2008，18 (6) :95-98)。生物有機肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體(如畜禽糞便、農作物秸桿等)為來源并經無害化處理、腐熟的有機物料復合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應的肥料。其本質特征是含有特定功能的、表現出一定肥料效應的微生物，這些功能微生物的生命活動是生物有機肥優于其它肥料的關鍵因素。生物有機肥發揮作用的關鍵在于肥料中有益微生物的數量，因此研究不同的配方和二次固體發酵工藝確保肥料中活菌數達到最高變得尤為重要。簡單將功能微生物與動植物殘體(如畜禽糞便、農作物秸桿等)為來源并經無害化處理、腐熟的有機物料進行混合堆置很難得到高質量的生物有機肥，前期研究表明在動植物殘體中加入少量外源氨基酸二次發酵功能微生物能夠顯著增加功能微生物的數量，提高肥料質量。外源氨基酸的種類很多，如菜餅(菜柏)、豆餅等，但此類氨基酸成本很高，尤其是豆餅，探求和開發新型低成本氨基酸則能夠大幅度提高生物有機肥的市場競爭力。
發明內容
技術問題本發明的目的在于針對生產實踐中的實際問題和需求，開發研制出利用藻泥固體發酵芽孢桿菌NJN-6研制高效香蕉專用生物有機肥的配方和工藝，降低香蕉專用生物有機肥的生產成本，生產的香蕉專用生物有機肥能夠顯著促進香蕉生長。技術方案下面為本發明的主要內容利用藻泥生產高效香蕉專用生物有機肥的工藝，包括I)將菌種保藏號為CGMCC NO. 3183的香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為pH6. O 7. 0，發酵溫度范圍30 350C，攪拌速度為180 300轉/分鐘，發酵中后期形成芽孢，發酵時間為48h，使發酵液中 含菌或芽孢量> I X IO10個/ml。所用PDA培養液配制方法為，以配制IL培養基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至 1000ml, pH 值調至 7. 2-7. 4，121°C滅菌 20min。2)將質量比7%藻泥(干重)、10%菜柏和83%的腐熟雞糞堆肥進行均勻混合，將功能菌NJN-6發酵液接入混合堆中進行固體發酵，每噸混合物料中加入功能菌菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆I次，使固體發酵溫度不超過50°C，發酵7天后結束，功能菌含量可達到lX108CFU/g(肥料干重)以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為成品香蕉專用生物有機肥。所用腐熟后的雞糞堆肥其發芽指數為98%以上，有機質質量比含量> 45%，有機氮質量比含量為2-3%，含水量質量比為25-30%。用上述配方工藝生產的微生物有機肥料中功能菌NJN-6活菌數> IXlO8CFU/g(肥料干重)，全氮含量為2. 5-3. 5%，總氮磷鉀養分為6-8%、有機質含量> 45%，微囊藻毒素LR和RR(microcystin_LR和microcystin-RR)的含量均低于4ug/kg。所述產品專用于促進香蕉生長和防控香蕉枯萎病的發生。有益效果本發明提供一種利用藻泥固體發酵芽孢桿菌NJN-6研制高效香蕉專用生物有機肥的配方和工藝。使用該發明生產的香蕉專用微生物有機肥成本低于傳統生物有機肥，使用方便，促生和抗病效果好的優點，適合香蕉種植區域大面積使用。本發明對于保護生態環境，保護人民的身體健康，提高農產品的附加值具有重要的意義。產品與目前市場上的產品相比具有如下優點I)本專利利用太湖打撈藻泥、菜餅和腐熟雞糞普通肥作為配方，二次固體發酵香蕉專用促生生防芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens NJN-6,研制出了香蕉專用生物有機肥。該配方及工藝能夠大幅度增加該新型生物有機肥中功能微生物的數量，在保證肥料效果的同時，降低了生物有機肥的成本，同時通過微生物的作用，藍藻里的大分子藻蛋白能夠被分解成小分子的氨基酸，可供植物直接利用，藻毒素能夠被大幅度降低，生產的產品具有極強的市場競爭力。2)肥料中高效菌株的含量達到lX108CFU/g(肥料干重)以上，遠遠超過國家標準2X107CFU/g，施入土壤后能形成優勢群，并在土壤中存活下來。太湖打撈藻泥蛋白質含量可達50%以上，氨基酸組份比較齊全，肥料產品中同時含有豐富的可溶性有機碳和有機氮，能夠顯著促進香蕉植株的生長。3)采用液相色譜法測定生物有機肥中藻毒素LR和RR的含量，結果表明微囊藻毒素LR和RR(microcystin_LR和microcystin-RR)的含量均低于4ug/kg(肥料干重),而我們測得原料純藻泥中微囊藻毒素LR和RR的含量分別為3. lmg/kg (藻泥鮮重)和62. 16mg/kg (藻泥鮮重)，因此放置兩月的藻泥再利用本專利技術固體發酵后能夠將藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg以下，目前國內外還沒有肥料中藻毒素的標準，僅僅有地下水中的標準，低于lug/kg。4)試驗結果表明，在香蕉幼苗期施用本產品后，能顯著促進香蕉植株的生長。
四
圖I不同含量藻泥與腐熟雞糞混合固體發酵NJN-6菌株的數量變化 圖2不同含量菜餅與腐熟雞糞、藻泥混合固體發酵NJN-6菌株的數量變化圖3生物有機肥促生效果圖
五具體實施例方式I、藻泥的獲得藻泥由太湖周邊打撈站免費提供，放置藻泥儲存池2個月。2、功能菌菌劑的生產將菌種保藏號為CGMCC NO. 3183的芽孢桿菌NJN-6 (公知公用，見授權發明專利ZL200910183361.3，防除連作香蕉巴拿馬枯萎病的拮抗菌及其微生物有機肥料。)接種到PDA培養液進行液體發酵生產，發酵條件為pH6. 0-7. 0，發酵溫度范圍30_35°C，攪拌速度為180-300轉/分鐘，發酵時間為48小時，發酵液的含菌或芽孢量> IOltl個/ml。所用PDA培養液配制方法為，以配制IL培養基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值調至7. 2-7. 4，121 °C滅菌 20min。3、固體發酵生成生物有機肥3. I固體發酵配方的獲得利用遞進法獲得固體發酵的配方，首先將藻泥以不同梯度加入腐熟雞糞堆肥中，發酵堆總重(干重)10kg，進行固體發酵，獲得最佳藻泥添加量，再在此基礎上加入菜餅確定菜餅的最佳添加量，獲得最終配方。發酵方式如下每噸固體有機物料中加入功能菌菌液50L,固體發酵過程中每天翻堆I次，使固體發酵溫度不超過50°C，一般發酵7天后結束。發酵完后測定各處理中的功能菌的數量，結果如圖，7%藻泥(干重)、10%菜柏和83%的腐熟雞糞堆肥為最佳配方，功能菌數量達到6X107CFU/g (干重)以上(圖I)。3. 2固體大堆發酵生成成品有機肥根據上述配方和工藝，將7%藻泥(干重)、10%菜柏和83%的腐熟雞糞堆肥進行均勻混合，發酵堆總重(干重)50噸，將促生生防菌NJN-6接入混合堆，每噸固體有機物料中加入功能菌菌液50L進行條剁式固體發酵，每天翻堆I次,使固體發酵溫度不超過50°C，發酵7天后結束；設計雞糞腐熟有機肥作為對照。發酵結束后新型生物有機肥中促生生防菌數量達到4.5X108CFU/g (干重)(圖2)，超雞糞腐熟有機肥越2個數量級。最后再進行殘留藻毒素的檢測，方法如下向IOOg肥料中加入100mL5%的乙酸，在-70和常溫下反復凍融多次后，12000r/min離心lOmin，分別取出上清液(I)和沉淀；將沉淀用100mL80%甲醇溶液震蕩提取4h，離心15min，得上清液(II);將上清液(I)與上清液(II)充分混合后得上清液(III)，將上清液(III)用稀鹽酸將PH調至3，靜置過夜后離心，棄殘渣，得上清液(IV)，將上清液(IV)用稀氨水將pH調至7后，40°C旋轉蒸發去除甲醇，將剩余樣品過O. 45 μ m濾膜得藻毒素粗提液。依次用20mL100%甲醇、20mL超純水活化C18固相萃取柱(500mg/6ml)，將藻毒素粗提液通過固相萃取柱進行富集濃縮，再分別用20mL10%以及20ml20%甲醇溶液淋洗固定相，最后用10mL80%甲醇溶液(加入O. 05%三氟乙酸)將吸附在固定相上的微囊藻毒素洗脫下來，將純化后的微囊藻毒素通過旋轉蒸發除去甲醇得MCs儲備液，將儲備液冷凍干燥后，用20%甲醇定容到2ml，液體供HPLC上機檢測。采用液相色譜法測定生物有機肥中藻毒素LR和RR的含量，結果表明微囊藻毒素LR和RR(microcystin_LR和microcystin-RR)的含量均低于4ug/kg(肥料干重),而我們測得原料純藻泥中微囊藻毒素LR和RR的含量分別為3. lmg/kg(藻泥鮮重)和62. 16mg/ kg (藻泥鮮重)，因此放置兩月的藻泥再利用本專利技術固體發酵后能夠將藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg以下，目前國內外還沒有肥料中藻毒素的標準，僅僅有地下水中的標準，低于lug/kg。所用腐熟后的雞糞堆肥其發芽指數為98%以上，有機質質量比含量> 45%，有含水量質量比25-30%。研制成的生物有機肥含有IX 108CFU/g(干重)以上的功能菌NJN-6、全氮含量為
2.5-3. 5% (90%以上為有機氮)，總氮磷鉀養分為6-8%、有機質含量大于45%。以上結果表明所研制配方和工藝完全能夠最大化的發酵生產新型生物有機肥，且該生物有機肥完全能夠符合國家標準。4、溫室試驗促生試驗在南京農業大學海南工作站溫室里進行，共設三個對照一個處理，處理為本專利研制的新型抗病促生生物有機肥處理(BIO)，對照分別為普通雞糞有機肥接入功能菌固體發酵后肥料處理(OF)、生物有機肥配方去除菜餅接功能菌固體發酵后肥料處理(BOF)和化肥對照(化肥處理與BIO等養分)。每個處理18盆，每盆裝IOkg 土，肥料的添加量為2%。肥料與土充分混合均勻，常規管理。定期測定香蕉生長指數。結果如圖3、表一、表二、表三、表四、表五、表六、表七和表八。I)株高與三個對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株的株高，移苗后十天即表現出顯著性差異，一直保持到移苗后50天。2)莖粗與OF和CK對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株的莖粗，移苗后十天即表現出顯著性差異。與BOF處理相比，30天以后達到顯著性差異。3)倒三片葉面積與OF和CK對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株的倒三片葉面積，移苗后十天即表現出顯著性差異。與BOF處理相比，20天以后達到顯著性差異。4)葉綠素含量與OF和CK對照相比，本專利研制的BIO處理移苗后前40天能夠增加植株的葉綠素含量，表現出顯著性差異。與BOF處理相比，移苗后20天和30天時達到顯著性差異。所有處理在50天時葉綠素含量無顯著性差異。5)葉片數量與CK、OF和BOF對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株葉片的數量，移苗后第20和50天均表現出顯著性差異。6)地上部鮮重和干重與OF和CK對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株地上部鮮重和干重，移苗后10天即表現出顯著性差異。與BOF處理相比，20天以后達到顯著性差異。7)地下部鮮重和干重與OF和CK對照相比，本專利研制的BIO處理能夠增加植株地下部鮮重和干重，移苗后10天即表現出顯著性差異。與BOF處理相比，20天以后達到顯著性差異。試驗結果整體表明，本專利研制的香蕉專用生物有機肥BIO能夠促進香蕉植株的生長，本研究的配方和工藝能夠顯著促進功能菌的二次固體發酵效率，增加肥料中功能菌的數量和肥料的養分，最終促進香蕉植株的生長。表一不同處理對香蕉株高的影響(單位cm)
權利要求
1.利用藻泥生產高效香蕉專用生物有機肥的工藝，包括 1)將菌種保藏號為CGMCCNO. 3183的香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6接種到PDA培養液，進行液體發酵生產，發酵生產的條件為pH6. O 7. 5，發酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉/分鐘，發酵中后期形成芽孢，發酵時間為48h，使發酵液中含菌或芽孢量> I X IOltl個/ml ;所用PDA培養液配制方法為，以配制IL培養基為例用200g 土豆削皮后切成小塊放到水里煮，沸騰后煮30min，經過濾后濾液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH 值調至 7. 2-7. 4，121°C 滅菌 20min ； 2)將質量比7%藻泥干重、10%菜柏和83%的腐熟雞糞堆肥進行均勻混合； 3)將香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6發酵液接入藻泥、菜柏和腐熟雞糞堆肥混合物中進行固體發酵，每噸混合物中加入功能菌菌液50L，固體發酵過程中每天翻堆I次,使固體發酵溫度不超過50°C，發酵7天后結束，功能菌含量可達到I X 108CFU/g肥料干重以上，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發至30%以下，包裝出廠即為成品香蕉專用生物有機肥；所用腐熟后的雞糞堆肥其發芽指數為98%以上，有機質質量比含量> 45%，有機氮質量比含量為2-3%，含水量質量比為25-30%。
2.權利要求I所述工藝生產的香蕉專用生物有機肥產品，該產品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。
3.根據權利要求I所述的香蕉專用生物有機肥產品，該產品中香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6活菌數> IX 108CFU/g肥料干重，全氮含量為2. 5-3. 5 %，總氮磷鉀養分為6-8%、有機質含量> 45%。
4.權利要求2和3所述產品用于香蕉大田種植，能夠促進香蕉生長和防控枯萎病的發生。
全文摘要
本發明提供了一種利用藻泥固體發酵芽孢桿菌NJN-6生產高效香蕉專用生物有機肥的工藝及產品。所用配方為腐熟雞糞普通肥(83％，重量比，下同)、太湖打撈藻泥(7％)和菜粕(10％)；所用菌株為香蕉專用促生生防芽孢桿菌NJN-6；工藝流程為將原料以上述最優配方混合，5％接入功能菌，條垛式發酵，每天翻拋1次，發酵7天。所生產的肥料有益活菌數大于1×108CFU/g(肥料干重，下同)，全氮含量為2.5-3.5％，總氮磷鉀養分為6-8％、有機質含量≥45％，微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4μg/kg。富含大量的有益氨基酸，促生效果好，抗病能力強。
文檔編號C05F15/00GK102887744SQ20121043638
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月1日 優先權日2012年11月1日
發明者沈其榮, 李 榮, 黃炎, 楊興明, 曹亮亮, 張苗, 施娟娟, 劉紅軍 申請人:南京農業大學, 江蘇新天地生物肥料工程中心有限公司