一種噬菌蛭弧菌微膠囊及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種噬菌蛭弧菌微膠囊，所述微膠囊的壁為明膠，顆粒呈球形，表面有凹陷，但沒有孔和裂紋，所述顆粒粒徑大小為3～12μm，分布基本均勻，且其中，噬菌蛭弧菌的含量為3.69×107pfu/g～3.70×107pfu/g，大腸桿菌DH5α的含量為8.6×109pfu/g～2.10×1010pfu/g。本發明還提供了該微膠囊的制備方法，其包括步驟：1)大腸桿菌DH5α菌懸液的制備；2)噬菌蛭弧菌培養液的制備；和3)將步驟1)的大腸桿菌DH5α菌懸液和步驟2)的噬菌蛭弧菌培養液與無菌明膠溶液均勻混合后，進行噴霧干燥，最終制備成微膠囊。該微膠囊明顯增加水產養殖業中的抗感染效果。
【專利說明】一種噬菌蛭弧菌微膠囊及其制備方法【技術領域】
[0001]本發明屬于水產飼用微生物添加劑【技術領域】，尤其涉及一種噬菌蛭弧菌微膠囊及其制備方法。
【背景技術】
[0002]近年來，集約化水產養殖業的快速發展導致作為水產動物疾病治療劑和生長促進劑的抗生素過度濫用，使水產品安全受到日益嚴峻的挑戰，并引起了一系列環境、衛生和社會問題。目前，歐洲、美國、日本等發達國家已明令禁用抗生素作為飼料添加劑，并在積極地尋找抗生素的替代品。因此，水產養殖業迫切需要既能滿足無公害要求又能使水產動物快速、健康生長的新型飼料添加劑。眾多研究表明，益生菌作為飼料添加劑飼喂水產養殖動物，能夠有效控制水產動物病原菌的增殖、促進動物生長作用，同時不會出現耐藥性，也不存在有害殘留或污染等副作用，有望成為替代抗生素、控制動物疾病的最有效的工具之一。
[0003]其中噬菌蛭弧菌是一種具有獨特噬菌特性的弧形或桿形細菌，是養殖水體環境致病菌滋生的天然生物控制因子，能夠有效地控制養殖水體的亞硝酸鹽和氨氮的含量，對開拓水產動物病害生物防治新途徑具有重要的意義。然而，我國噬菌蛭弧菌制劑絕大多數為液體制劑和凍干粉劑，但液體制劑普遍存在菌數下降快，貯藏期短，運輸不便，容易受到消化道內高酸、高酶環境的影響而死亡等很多缺陷，凍干粉劑生產成本高，難以滿足水產養殖業的要求。
[0004]申請號為201110088162.1、名稱為一種粉狀噬菌蛭弧菌制劑及其制備方法的中國發明專利披露了一種粉狀噬菌蛭弧菌制劑，但是該制劑同樣地易受消化道內高酸、高酶環境的影響，而影響抗感染效果。
【發明內容】
`[0005]為克服現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種性價比高的噬菌蛭弧菌新型制劑，即，噬菌蛭弧菌微膠囊，作為水產養殖業的飼料添加劑。
[0006]本發明的微膠囊技術采用的是噴霧干燥法，這是以單一工序將溶液、乳液、懸浮液或漿狀物經霧化器作用，噴成非常細微的霧滴，并依靠干燥介質(熱空氣、冷空氣、煙道氣或惰性氣體)與霧滴均勻混合，進行熱交換和質交換，使得溶劑氣化或使得熔融物固化，最終加工成粉狀干燥制品的一種干燥法，其操作費用低，生產效率高，生產過程簡單，產品的分散性和溶解性較好，是食品或食品添加劑行業普遍采用的生產方法之一。例如，程艷薇等利用噴霧干燥技術生產了嗜酸乳桿菌菌粉，為生產泡椒的穩定與縮短發酵時間提供了有力的保障，戚薇等采用噴霧干燥的方法制備了凝結芽孢桿菌微膠囊，大大提高了凝結芽孢桿菌的保藏期。
[0007]本發明所用噬菌蛭弧菌微膠囊有效含菌量的測定方法為:無菌操作取噬菌蛭弧菌微膠囊0.01g于IOml無菌蒸餾水中，于37°C水浴溶解后采用自來水雙層瓊脂平板進行有效含菌量的測定(Pfu/g)。[0008]本發明噬菌蛭弧菌微膠囊的形態觀察方法:用雙面膠將噬菌蛭弧菌微膠囊固定于掃描電子顯微鏡的樣品臺上，然后在離子濺射儀中鍍一薄層金，最后用掃描電子顯微鏡觀察其形態并拍照。
[0009]本發明一方面提供了一種噬菌蛭弧菌微膠囊，該微膠囊的壁為明膠，該微膠囊的顆粒呈球形，表面有凹陷，但沒有孔和裂紋，微膠囊顆粒粒徑大小為3~12 μ m,分布基本均勻，且其中噬菌蛭弧菌的含量為3.69\107?血/^~3.70\107?血/^，大腸桿菌0冊(1的含量為 8.6 X 109pfu/g~2.1OX 1010pfu/g。
[0010]本發明另一方面提供了一種噬菌蛭弧菌微膠囊的制備方法，其包括如下步驟:
[0011]I)在無菌條件下取-70°C甘油保藏的大腸桿菌DH5 α接種于ΡΗ7.2的普通營養肉湯中，于30°C, 200r/min搖床振蕩培養18h后于6000r/min離心20min,用無菌生理鹽水洗滌3次，制成2.0X1010pfu/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸液。
[0012]2)取_70°C甘油保藏的終濃度為2.0X 104pfu/ml的噬菌蛭弧菌接種于ρΗ7.2的10倍稀釋的普通營養肉湯中制成曬菌蛭弧菌培養液，同時在每100ml所述曬菌蛭弧菌培養液中加入步驟I)的大腸桿菌DH5a菌懸液ΙΟΟμ 1，于30°C、200r/min條件下搖床振蕩培養直至噬菌蛭弧菌的活菌含量為4.0X 105pfu/ml。
[0013]3.將步驟2的噬菌蛭弧菌培養液與無菌明膠溶液均勻混合后，進行噴霧干燥，最終制備成微膠囊其中，明膠的濃度為1_6%，空氣流量設置為650-850L/h，進料速度設置為6-14ml/min，進風溫度為 120°C _160°C。
[0014]明膠是一種親水性高分子膠體，來源廣泛，價格低廉，乳化性、成膜性能好，理化性能穩定，且不易與油脂類分子發生反應，因此經常會被用作微膠囊壁材，明膠是一種良好的噴霧干燥熱保護劑。本發明還發現明膠還可以作為噬菌蛭弧菌微膠囊制備的抗熱保護劑。本發明披露的噴霧干燥法制備噬菌蛭弧菌微膠囊的明膠溶液濃度為1_6%，優選為2%。該明膠溶液濃度使得噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量最大化。
[0015]空氣流量的大小決定進料速度和壁材的流化狀態，因而是影響噴霧干燥質量和微膠囊顆粒均勻性的重要參數。因此，在噴霧干燥工藝中確定合適的空氣流量既能夠防止壁材過多地吸附于柱筒壁上，又可以保證壁材充分流化。空氣流量對微膠囊顆粒的壁厚大小具有明顯的影響。根據本發明的實施例，本發明的噬菌蛭弧菌微膠囊制備方法的噴霧干燥步驟中的空氣流量為650-850L/h，最優選為750L/h時的顆粒形態比較均一。
[0016]進料速度是影響噬菌蛭弧菌噴霧干燥工藝優劣的關鍵參數之一，會對噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量產生影響者。根據本發明的實施例，最適進料速度為6-14ml/min，最優選為8ml/min。在這些條件下，噬菌蛭弧菌微膠囊的質量高，尤其是有效含菌量高。
[0017]進風溫度是影響噬菌蛭弧菌噴霧干燥工藝優劣的關鍵參數之一，會對噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量產生影響者。根據本發明的實施例，本發明的噴霧干燥法制備噬菌蛭弧菌微膠囊的方法，其噴霧干燥步驟中，最適進風溫度為120°C _160°C，最優選為140°C。
[0018]根據本發明最優選是的實施例，當明膠濃度為2%、空氣流量為750L/h、進料速度為8ml/min、進風溫度為140°C時，噬菌蛭弧菌F16微膠囊的有效含菌量最高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明進行詳細說明:[0020]圖1為柱狀圖，顯示了本發明明膠溶液濃度對噬菌蛭弧菌微膠囊有效含菌量的影響；
[0021]圖2為柱狀圖，顯示了空氣流量對噬菌蛭弧菌微膠囊有效含菌量的影響；
[0022]圖3為柱狀圖，顯示了進料速度對噬菌蛭弧菌微膠囊有效含菌量的影響；
[0023]圖4為柱狀圖，顯示了進風溫度對噬菌蛭弧菌微膠囊有效含菌量的影響；
[0024]圖5為本發明的噬菌蛭弧菌微膠囊在電子顯微鏡下的形態；
[0025]圖6為噬菌蛭弧菌微膠囊對異育銀鯽抗嗜水氣單胞菌SI感染的效果。
【具體實施方式】
[0026]實驗材料
[0027]噬菌蛭弧菌F16、嗜水氣單胞菌SI，購于國家水生動物病原庫；大腸桿菌DH5a，購于天根生物基因技術有限公司。蛭菌110，為噬菌蛭弧菌液體制劑，購于南京仕必得生物技術有限公司；粉狀噬菌蛭弧菌制劑，以沸石粉作為賦型載體，根據第201110088162.1號中國專利制備而成；異育銀鯽，平均體重為46.5±2.3g,購于江蘇南通農場。
[0028]明膠、普通營養肉湯、瓊脂條、無菌蒸餾水和無菌生理鹽水，購于上海國藥集團化學試劑有限公司；pH7.2的10倍稀釋的普通營養肉湯(1/10營養肉湯)、pH7.2的普通營養肉湯、終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的明膠溶液、自來水雙層瓊脂平板，底層瓊脂濃度
1.5%，上層軟瓊脂濃度0.6%，均在I X IO5Pa高壓濕熱滅菌20min后備用；溫控搖床，購于美國Thermo Forma公司；生化培養箱，購于上海一恒生物科技有限公司；全自動滅菌鍋和高速離心機，購于日本三洋公司；漩渦振蕩儀，購于上海淇特分析儀器有限公司；小型噴霧干燥儀SY-6000，購于上海世遠生物設備工程有限公司。
[0029]技術參數
[0030]1、最大蒸發水量:1800ml/h ;水；
[0031]2、進風溫度:30 ?250°C ±1°C ;
[0032]3、出風溫度:30 ?120 °C ;
[0033]4、鼓風機干燥空氣流量:正常空氣流量70m3/h (最大330m3/h);壓力686Pa ；
[0034]5、鼓風機功率:0.1KW/220V ；
[0035]6、管道電加熱器能力:3.2KW ;
[0036]7、進風溫度加熱控制:Pt_100，智能PID控制
[0037]8、空氣壓縮機:0.25KW，最大產氣量4.2m3/h,工作壓力2?5bar ；
[0038]9、噴霧系統:帶有標準0.7mm 口徑雙流體噴嘴(內部混合)，也可選擇其他尺寸的噴嘴；
[0039]10、平均干燥時間:1.0?1.5秒;
[0040]11、自動排堵裝置:自動通針排堵疏通頻率可調，周期設定范圍為O?60秒/次；
[0041]12、與產品接觸材料:耐酸316L不銹鋼，3.3硼硅玻璃；
[0042]13、尺寸(WXDXH):700 X 650 X IlOOmm ;
[0043]14、電源電壓:220/230V，50 ?60Hz ；
[0044]15、整機額定功率:3.8KW;
[0045]16、重量:58kg[0046]制備過程
[0047]1、準備原料:即準備噬菌蛭弧培養液、無菌明膠溶液；
[0048]2、調配:即噬菌蛭弧培養液與無菌明膠溶液按照一定的比例混合；
[0049]3、均質:即將噬菌蛭弧培養液與無菌明膠溶液的混合物在磁力攪拌器上于30°C、100r/min充分混合均勻，并插入噴霧干燥機的進料管；
[0050]4、噴霧干燥:即先打開空氣壓縮機(上海復宏機電有限公司生產)，將壓縮機的壓力調到0.6^0.8MPa，待壓縮機內部壓力達到這一數值時，氣壓穩定，打開噴霧干燥機的開關，然后分別設置噴霧干燥的通針頻率、進料速度、進風溫度和空氣流量參數，其中，通針的作用是防止進料堵塞了噴氣孔，所以需要根據原料的不同粘稠度調節合適的通針頻率；
[0051]5、收集微膠囊粉末，收集器收集噴霧干燥產生的微膠囊粉末，并用無菌條件下將微膠囊粉末從收集器中取出；
[0052]6、檢測，即檢測微膠囊的顆粒粒徑，形態及含菌量。
[0053]圖5顯示了本發明示例性噬菌蛭弧菌微膠囊在電子顯微鏡下的鏡像，噬菌蛭弧菌微膠囊的顆粒呈球形，表面有凹陷，但沒有孔和裂紋，顆粒粒徑分布基本均勻，大小為3~12 μ m。
[0054]大腸桿菌DH5a菌懸液的制備
[0055]在無菌條件下取_70°C甘油保藏的大腸桿菌DH5 α接種于PH7.2的普通營養肉湯中，于30°C, 200r/min搖床振蕩培養18h后于6000r/min離心20min,用無菌生理鹽水洗漆3次，制成2.0X1010pfu/ml的大腸桿菌DH5 α菌懸`液。
[0056]噬菌蛭弧菌F16培養液的制備
[0057]取_70°C甘油保藏的終濃度為2.0X104pfu/ml的噬菌蛭弧菌F16接種于100mlPH7.2的10倍稀釋的普通營養肉湯中，同時加入100 μ l/100ml大腸桿菌DH5 α菌懸液，于30°C、200r/min條件下搖床振蕩培養48h后噬菌蛭弧菌F16的活菌含量為4.0X 105pfu/ml，于4°C冰箱保存。
[0058]實施例1
[0059]明膠濃度對噬菌蛭弧菌F16微膠囊有效菌含量的影響:無菌操作取噬菌蛭弧菌F16培養液ImL加入終濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的無菌明膠溶液中，然后在磁力攪拌器上于30°C、100r/min充分混合均勻，并在進風溫度130°C、進料速度10ml/min、空氣流量700L/h、通針頻率IOs等條件下進行噴霧干燥，分別對不同明膠濃度下制備的噬菌蛭弧菌F16微膠囊進行有效含菌量的測定。實驗結果見圖1。
[0060]圖1的柱狀圖，縱坐標為細菌含量對數值，橫坐標為明膠溶液濃度。從該柱狀圖可以看出，當明膠濃度為2%時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量最高。具體表現在:當明膠濃度為1%時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量的對數值比明膠濃度為2%時降低了 11.45%(P〈0.05);當明膠濃度分別為3%、4%、5%和6%時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量的對數值比明膠濃度為 2% 時也分別降低了 8.96% (Ρ〈0.05)、10.72% (Ρ〈0.05)和 18.80% (Ρ〈0.05)。
[0061]實施例2
[0062]空氣流量對噬菌蛭弧菌F16微膠囊有效含菌量的影響:無菌操作取噬菌蛭弧菌F16培養液ImL加入終濃度為2%的無菌明膠溶液中，然后在磁力攪拌器上于30°C、100r/min充分混合均勻，并在空氣流量分別為600、650、700、750、800L/h以及進風溫度130°C、進料速度10ml/min、通針頻率IOs等條件下進行噴霧干燥，分別對不同空氣流量下制備的噬菌蛭弧菌F16微膠囊進行有效含菌量的測定。實驗結果見圖2。
[0063]圖2的柱狀圖，縱坐標為細菌含量對數值，橫坐標為進風溫度。從該柱狀圖可以看出，當空氣流量為750L/h時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量最高。具體表現在:當空氣流量為650L/h和700L/h時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量的對數值比空氣流量為750L/h 時降低了 11.13% (Ρ〈0.05)和 4.08% (Ρ〈0.05);當空氣流量為 800L/h 和 850L/h 時，噬菌蛭弧菌F16微膠囊的有效含菌量的對數值比空氣流量為750L/h時也分別降低了 18.59%(Ρ〈0.05)和 25.21% (Ρ〈0.05)。
[0064]實施例3
[0065]進料速度對噬菌蛭弧菌F16微膠囊有效含菌量的影響:無菌操作取噬菌蛭弧菌F16培養液ImL加入終濃度為2%的無菌明膠溶液中，然后在磁力攪拌器上于30°C、100r/min充分混合均勻，并在進料速度分別為6、8、10、12、14ml/min以及進風溫度130°C、空氣流量750L/h、通針頻率IOs等條件下進行噴霧干燥，分別對不同進料速度下制備的噬菌蛭弧菌F16微膠囊進行有效含菌量的測定。實驗結果見圖3。
[0066]圖3的柱狀圖，縱坐標為細菌含量對數值，橫坐標為進料速度。從該柱狀圖可以看出，當進料速度為8ml/min時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量最高。具體表現在:當進料速度為6ml/min時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量的對數值比進料速度為8ml/min時降低了 11.87%(P〈0.05);當進料速度為10ml/min、12ml/min和14ml/min時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量較進料速度為8ml/min時也分別降低了 0.84% (Ρ〈0.05)、2.65% (Ρ〈0.05)和 2.37% (Ρ〈0.05)。
[0067]實施例4
[0068]進風溫度對噬菌蛭弧菌F16微膠囊有效含菌量的影響:無菌操作取噬菌蛭弧菌F16培養液ImL加入終濃度為2%的無菌明膠溶液中，然后在磁力攪拌器上于30°C、100r/min充分混合均勻，并在進風溫度分別為120°C、130°C、140°C、150°C、160V以及進料速度10ml/min、空氣流量750L/h、通針頻率IOs等條件下進行噴霧干燥,分別對不同進風溫度下制備的噬菌蛭弧菌F16微膠囊進行有效含菌量的測定。實驗結果見圖4。
[0069]圖4的柱狀圖，縱坐標為細菌含量對數值，橫坐標為空氣流量。從該柱狀圖可以看出，當進風溫度為120°C和130°C時，噬菌蛭弧菌微膠囊的有效含菌量隨進風溫度的升高而逐漸增加，其有效含菌量的對數值分別比進風溫度為140°C時降低19.68% (P〈0.05)和
5.42% (Ρ〈0.05);當進風溫度為150°C和160°C時，噬菌蛭弧菌F16微膠囊的有效含菌量隨進風溫度的升高而逐漸減少，其有效含菌量的對數值比進風溫度為140°C時分別降低了12.15% (Ρ〈0.05)和 17.83% (Ρ〈0.05)。
[0070]實施例5:噬菌蛭弧菌F16微膠囊對異育銀鯽抗嗜水氣單胞菌感染的效果實驗
[0071]實驗設I個空白對照組和3個實驗組，每組設3個平行，各隨機投放異育銀鯽20尾。空白對照組異育銀鯽投喂基礎飼料，3個實驗組異育銀鯽分別投喂含lX104pfu/g飼料的噬菌蛭弧菌F16微膠囊、蛭菌110和粉狀噬菌蛭弧菌制劑的試驗飼料，連續投飼14天，日投飼量為異育銀鯽總體重的1%。之后參照Schadich等(Schadich E.，Cole A.L.J..Pathogenicity ofAeromonas hydrophila,Klebsiellapneuoniae，and Proteus mirabilisto brown tree frogs (Litoria ewingii) [J].Comparative Medicine, 2010, 60(2): 114-117.)的方法用嗜水氣單胞菌SI對每組異育銀鯽進行人工浸浴創傷感染，其中嗜水氣單胞菌SI的終濃度為6.0X 108cfu/mL，連續14 天參照 Bucke (Bucke D.Histology.1n:Austin B., Austin D.A.(Eds).Methods forthe microbiological examination of fish andshellfish.John Wiley & Sons, NewYork, USA, 1989.pp.69-97.)的方法檢測并記錄各組嗜水氣單胞菌SI感染致死異育銀鯽的死亡數目，計算成活率。實驗期間水溫控制在28°C，連續充氧，不定期換水、吸污。實驗結果見圖6。
[0072]圖6顯示了，噬菌蛭弧菌微膠囊對異育銀鯽抗嗜水氣單胞菌SI感染具有良好的效果。經人工感染后，各組異育銀鯽均不同程度地出現死亡，而以lX104pfu/g飼料劑量投喂噬菌蛭弧菌F16微膠囊的異育銀鯽在人工感染嗜水氣單胞菌SI后14天的成活率較對照組異育銀鯽的成活率提高了 30% (P〈0.05)，較以lX104pfu/g飼料劑量投喂蛭菌110的異育銀鯽的成活率提高了 13.3% (P〈0.05)，較以lX104pfu/g飼料劑量投喂粉狀噬菌蛭弧菌制劑的異育銀鯽的成活率提高了 8.3%(P〈0.05)，說明噬菌蛭弧菌F16微膠囊能夠顯著增加噬菌蛭弧菌液體制劑的抗病效果。
[0073]但是，本【技術領域】中的普通技術人員應當認識到，以上的實施例僅是用來說明本發明，而并非用作為對本發明的限定，只要在本發明的實質精神范圍內，對以上所述實施例的變化、變型都將落在本發明的權利要求書范圍內。
【權利要求】
1.一種噬菌蛭弧菌微膠囊，其中，所述微膠囊的壁為明膠，顆粒呈球形，表面有凹陷，但沒有孔和裂紋，所述顆粒粒徑大小為3?12 μ m，分布基本均勻，且其中，噬菌蛭弧菌的含量為 3.69 X 107pfu/g ?3.70 X 107pfu/g,大腸桿菌 DH5 α 的含量為 8.6 X 109pfu/g ?2.10X101Qpfu/g。
2.—種噬菌蛭弧菌微膠囊的制備方法，其包括如下步驟: 1)在無菌條件下取_70°C甘油保藏的大腸桿菌DH5a接種于pH7.2的普通營養肉湯中，于30°C,在200r/min搖床振蕩培養后，離心，并用無菌生理鹽水洗漆，制成含大腸桿菌DH5 a 2.0X1010pfu/ml的大腸桿菌DH5 a菌懸液。 2)取_70°C甘油保藏的終濃度為2.0X 104pfu/ml的噬菌蛭弧菌接種于pH7.2的10倍稀釋的普通營養肉湯中制成曬菌蛭弧菌培養液，同時在每IOOml所述曬菌蛭弧菌培養液中加入步驟I)的大腸桿菌5a菌懸液100μ 1，于30°C、200r/min條件下搖床振蕩培養直至噬菌蛭弧菌的活菌含量為4.0X 105pfu/ml。 3).將步驟2)的噬菌蛭弧菌培養液與濃度為1-6%的無菌明膠溶液均勻混合后，在空氣流量設置為650-850L/h，進料速度設置為6-14ml/min，進風溫度為120°C _160°C的條件下，進行噴霧干燥。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述大腸桿菌DH5a在所述搖床振蕩培養18h后用6000r/min離心20min,并用所述無菌生理鹽水洗漆3次。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述明膠的濃度為2%。
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述空氣流量為750L/h。
6.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述進料速度為8ml/min。
7.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述進風溫度為140°C。
8.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述明膠濃度為2%、所述空氣流量為750L/h、所述進料速度為8ml/min、且所述進風溫度為140°C。
【文檔編號】A23K1/00GK103719535SQ201210383061
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月10日 優先權日:2012年10月10日
【發明者】曹海鵬, 何珊 申請人:上海海洋大學, 曹海鵬