專利名稱：兩面針組織培養培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及組織培養基，尤其涉及一種兩面針組織培養培養基。
背景技術：
兩面針(Zanthoxylum nitidum),為蕓香科植物，因其葉片中脈兩面均有小鉤刺，故稱“兩面針”，又名兩背針、釘板刺(福州)、入山虎、麻藥藤、入地金牛、葉下穿針、紅倒鉤筋、大葉描爪簕(廣東、廣西)。兩面針喜生長在溫熱、陽光充足的地方，山地、丘陵、平地的疏林、灌叢中、荒山草坡的有刺灌叢中較常見，主要分布在我國廣東、廣西、福建、海南、云南、貴州及臺灣等地。兩面針是我國較常用的一種中藥材，根莖、葉、果皮均可入藥，有活血、散瘀、鎮痛、消腫等功效。現代藥用化學研究表明兩面針的根莖含有生物堿oxynitidine，N-demethoxycheIerythrone, dihydronitidine， skimmianine,6-ethoxychelerythrin e,a -allocryptopine,nitidine等。局部應用時,對神經末梢有麻醉作用，且麻醉效果穩定，無不良反應，也無肝腎損害等，是一種具有廣闊藥用前景的中藥材，因此開展兩面針的基礎研究，具有十分重要的意義。目前，國內已有一些兩面針組培技術初步研究報道，在培養基的選擇上一般采用基本培養基(MS)和生長調節劑的結合，但是兩面針種源產地不同，組織培養條件也不同，SP使是同一產地的兩面針種源，選用不同單株作外植體，組織培養條件也不同。MS培養基適用于部分產地兩面針組織培養，部分產地兩面針種源和兩面針單株用MS培養基進行繼代培養，先葉片變黃、變白，繼而莖變黃、變白，芽苗死亡，無法繼續進行繼代培養。如果不同產地兩面針種源、或兩面針單株使用一種培養基，生產操作難度大，成本高，不利于規模化生產。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種兩面針組織培養培養基，該培養基包括繼代培養基和生根培養基，其中每升(L)繼代培養基的組分及各組分的含量如下(I)大量元素硝酸鉀1250mg/L、硝酸銨1000mg/L、七水硫酸鎂370mg/L、二水氯化隹丐166mg/L、磷酸二氫鉀150mg/L、乙二胺四乙酸二鈉56. 0mg/L、七水硫酸亞鐵41. 7mg/L ；(2)微量元素四水硫酸錳25mg/L、七水硫酸鋅10mg/L、硼酸10mg/L、二水鑰酸鈉0. 25mg/L、碘化鉀 0. 083mg/L、五水硫酸銅 0. 025mg/L ；(3)有機物肌醇100. 0mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、鹽酸硫胺素(VB1) 0. 5mg/L、鹽酸批哆醇(VB6) 0. 5mg/L、葉酸 0. 5mg/L、生物素(VH) 0. 05mg/L ；(4)植物生長調節劑6_芐基腺嘌呤0. 4 I. 0mg/L、萘乙酸0. 2 0. 5mg/L ；余量為蒸餾水。每升(L)生根培養基的組分及各組分的含量如下(I)大量元素硝酸鉀1250mg/L、硝酸銨1000mg/L、七水硫酸鎂370mg/L、二水氯化隹丐166mg/L、磷酸二氫鉀150mg/L、七水硫酸亞鐵33. 4mg/L、乙二胺四乙酸二鈉44. 8mg/L ；
(2)微量元素四水硫酸錳25mg/L、七水硫酸鋅10mg/L、硼酸10mg/L、二水鑰酸鈉O. 25mg/L、碘化鉀 O. 083mg/L、五水硫酸銅 O. 025mg/L ；(3)有機物肌醇100. Omg/L、甘氨酸2. Omg/L、鹽酸硫胺素(VB1) O. 5mg/L、鹽酸批哆醇(VB6) O. 5mg/L、葉酸 O. 5mg/L、生物素(VH) O. 05mg/L ；(4)植物生長調節劑:生根粉ABT6號O. 4 O. 8mg/L、萘乙酸O. 2 O. 4mg/L ；余量為蒸餾水。本發明兩面針組織培養培養基中的繼代、生根培養基的配制方法為I母液配制I. I為便于取樣，宜先配制各種母液，分為大量元素母液、微量元素母液、有機物母液和各種植物生長調節劑母液。蔗糖、瓊脂不宜配成母液，需要時直接稱樣；·I. 2大量元素母液和有機物母液的各組分濃度應與培養基的組分濃度成10 100的倍數關系，微量元素母液成200 500的倍數關系，而植物生長調節試劑母液的濃度宜配成 lmg/ml ；I. 3母液選用無菌的蒸餾水、去離子水或超純水配制，大量生產時用煮沸過的水；I. 4配制大量元素母液時，每個組分應單獨溶解，后按氮、鈣、鎂、磷的順序逐個混合，否則容易引起沉淀；I. 5微量元素母液含有見光易分解的碘化鉀和易氧化的硫酸亞鐵，應用棕色瓶保存；I. 6植物生長調節劑母液和有機物母液應置于冰箱中保存；I. 7母液配制后應及時使用，貯存時間不宜超過I個月；I. 8發現母液有沉淀，或有微生物生長，或有藻類生長，應廢棄不用。2培養基配制2. I依照培養基配方，按比例量取母液，加水定容后轉至不銹鋼鍋等容器內；2. 2加入適量凝固劑和糖，并攪拌使凝固劑充分分散，糖充分溶解；2. 3加熱至剛沸騰，使凝固劑完全溶解。若采用邊分裝邊攪拌的自動化儀器配制培養基時，可省去加熱使凝固劑溶解的過程；2. 4用I. ON鹽酸或I. ON氫氧化鈉調整至適當的酸堿度；2. 5盡快將培養基分裝到培養器皿內，以免培養基凝固或變稠而難以分裝；2. 6分裝培養基時應避免培養基粘到瓶口，一旦粘上，應擦除干凈，否則容易引起污染。3培養基消毒3. I將分裝好的培養基放入高壓消毒鍋內消毒；3. 2加熱初期，當消毒鍋消毒室的氣壓達O. 05Mpa時，打開冷凝閥，排盡消毒室內冷空氣；3. 3當消毒室內氣壓達到O. llMpa、溫度達121°C時，開始計時，保持溫度與壓力消毒15 20分鐘；3. 4關閉加熱電源開關，按慢排氣方式排放熱氣，待消毒室內的氣壓降至大氣壓時打開消毒鍋蓋或門，取出培養基；3. 5培養基應置于空氣少流動和少灰塵的干凈環境冷卻，否則在降溫進氣過程中導致霉菌孢子進入培養器皿，產生霉菌污染。或用高壓高溫消毒過的厚布包裹冷卻。 4培養基儲藏 4. I培養基應盡量現配現用。4. 2可在空氣干凈且不流動的環境短時間儲藏培養基，但儲藏超過I個月的培養基應廢棄不用。本發明兩面針組織培養的方法為I.芽的誘導于晴天選取生長健壯的、無病蟲害的兩面針植株，剪取半木質化的幼嫩枝條作為外植體，剪去葉片(留葉柄)，用加有少許洗潔精的水清洗I 2次，再用流水沖洗干凈，然后在超凈工作臺上用O. 1%的氯化汞消毒6-7分鐘并搖動數次，最后用無菌水清洗4 5次， 將已經消毒好的材料剪切成約2cm長段，每段留I 2個腋芽，然后斜插或垂直插在誘導芽的培養基中。外植體初次培養時，需全暗培養10 15天腋芽即可開始萌動，然后再移至見光的地方培養。2.芽的增殖培養當腋芽萌動長至Icm左右時，切取腋芽誘導分化叢生芽即可進行芽的繼代增殖，一般一個月繼代一次，繼代材料均放在室內培養，培養室溫度為(26±2) °C，光照12h.tr1，光照度2000 30001x。3.生根的誘導當叢生芽長至3cm左右時，可選取較健壯的芽轉移到生根培養基中，進行生根誘導，其余芽叢可轉移到新配的繼代培養基中讓其繼續增殖。芽條轉入生根培養基中后，先在室內弱光條件下培養15天左右，發根率到50%時(冬季氣溫低室內培養20天左右，發根率達70%以上)搬到室外煉苗大棚在自然散射光照培養10 20天(秋冬時間稍長)。4.生根苗的移栽 待生根小苗充分木質化，葉片舒展，葉色濃綠，苗莖深綠，莖軸伸長，苗高4cm左右時即可進行移栽。移栽時倒出培養基，取出小苗，用水洗凈殘留在根上的培養基，并截去過長的根系，保留2 2. 5cm長，移栽于經O. 2%高錳酸鉀消毒過的營養袋中，淋透水，覆蓋薄膜保持一定的溫度和濕度，并要避免陽光直射。本發明的優點是I、兩面針種源產地和單株不同，組織培養條件也不同，MS培養基適用于部分產地兩面針組織培養，本發明更適合不同產地的兩面針和不同兩面針單株的組織培養。2、部分產地兩面針種源用MS培養基進行繼代培養，先葉片變黃、變白，繼而莖變黃、變白，無法繼續進行繼代培養；用本發明培養基對兩面針進行培養，調整了大量元素用量，增加了七水硫酸亞鐵的含量，繼代周期20 25天，增殖系數4 6，繼代苗生長良好，小苗粗壯、整齊，葉色濃綠、黃化苗(葉片、莖葉逐漸變黃)少，得苗率高。3、在生根培養基中增加七水硫酸亞鐵的含量，用生根培養基進行培養生根苗生根率可達90%、出根快,溫度25±2°C時,平均出根時間為10 15天，根系發達，出根量多平均有3 5條根，小苗木質化好，移栽成活率高，移栽成活率達90%以上，瓶苗出圃時間平均為30天左右。與目前現有技術的兩面針組織培養基相比，本發明的優點是
權利要求
1.一種兩面針組織培養培養基，該培養基包括繼代培養基和生根培養基，其特征在于: 每升(L)繼代培養基的組分及各組分的含量如下 Cl)大量元素硝酸鉀1250mg/L、硝酸銨1000mg/L、七水硫酸鎂370mg/L、二水氯化鈣166mg/L、磷酸二氫鉀150mg/L、乙二胺四乙酸二鈉56. Omg/L、七水硫酸亞鐵41. 7mg/L ； (2)微量元素四水硫酸錳25mg/L、七水硫酸鋅10mg/L、硼酸10mg/L、二水鑰酸鈉O.25mg/L、碘化鉀 O. 083mg/L、五水硫酸銅 O. 025mg/L ； (3)有機物肌醇100.Omg/L、甘氨酸2. Omg/L、鹽酸硫胺素O. 5mg/L、鹽酸卩比卩多醇O. 5mg/L、葉酸 O. 5mg/L、生物素 O. 05mg/L ； (4)植物生長調節劑6_芐基腺嘌呤O.4-1. Omg/L、萘乙酸O. 2-0. 5mg/L ； 余量為蒸餾水。
2.根據權利要求I所述的兩面針組織培養培養基，其特征在于 每升(L)生根培養基的組分及各組分的含量如下 Cl)大量元素硝酸鉀1250mg/L、硝酸銨1000mg/L、七水硫酸鎂370mg/L、二水氯化鈣166mg/L、磷酸二氫鉀150mg/L、七水硫酸亞鐵33. 4mg/L、乙二胺四乙酸二鈉44. 8mg/L ； (2)微量元素四水硫酸錳25mg/L、七水硫酸鋅10mg/L、硼酸10mg/L、二水鑰酸鈉O.25mg/L、碘化鉀 O. 083mg/L、五水硫酸銅 O. 025mg/L ； (3)有機物肌醇100.0mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、鹽酸硫胺素0. 5mg/L、鹽酸卩比卩多醇0. 5mg/L、葉酸 O. 5mg/L、生物素 O. 05mg/L ； (4)植物生長調節劑生根粉ABT6號0.4-0. 8mg/L、萘乙酸0. 2-0. 4mg/L ； 余量為蒸餾水。
全文摘要
本發明公開了一種兩面針組織培養培養基，該培養基包括繼代培養基和生根培養基。在H培養基的基礎上進行了改良，調整了大量元素用量，增加了七水硫酸亞鐵的含量，本發明更適合不同產地的兩面針和兩面針單株組織培養。繼代周期20～25天，增殖系數4～6，繼代苗生長良好，小苗粗壯、整齊，葉色濃綠、無黃化苗，得苗率高。生根苗出根率可達90%、出根快，溫度25±2℃時，平均出根時間為10～15天，根系發達，出根量多平均有3～5條根，小苗木質化好，移栽成活率達90%以上，瓶苗出圃時間平均為30天左右。
文檔編號A01H4/00GK102884981SQ201210364900
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月26日 優先權日2012年9月26日
發明者時群, 陳麗文, 吳紅英, 陳乃明, 何貴整, 鄧月梅, 梁小娟, 譚冬曉, 蔡林, 梁剛, 謝云 申請人:欽州市林業科學研究所