專利名稱：一種龍山百合高效脫毒工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種龍山百合高效脫毒工藝，特別是針對龍山百合，具有極高脫毒效率的脫毒新技術。
背景技術：
湘西龍山縣是中國著名的“百合之鄉”，常年種植面積穩定在5萬畝以上，占全國種植面積的1/6，是全國種植百合最多的縣份。百合在生產上主要以扦插繁殖和分球繁殖等無性繁殖為主。長期以來，龍山百合種苗基本上依靠農民自留，品種退化嚴重。近年來，百合病毒病已普遍存在于全縣各百合產區，侵染率已達100%，產量和品質正逐年下降，嚴重制約了百合產業的發展。如何減少和消除病毒病，生產優質無毒種苗，是龍山縣百合種球商 品化生產面臨的一個重要問題。目前，國內外尚無有效藥劑防治病毒病的條件下，最方便可靠的措施是通過莖尖組織培養，生產脫毒種球(除去病毒，同時也除去真菌、細菌、線蟲等其它病原物)。病毒病主要是通過營養體無性繁殖傳播的。無性繁殖方式的優點在于能保持其后代遺傳基礎的一致，較少發生變異。然而長期的無性繁殖將會使體內逐漸積累大量病毒致使植物發生病毒病，并導致種性退化。自SteWart(1896)描述百合的壞死條紋以來，相繼報道了百合的病毒病原14種。其中發生普遍、危害嚴重的病毒有5種。即百合潛隱病毒(Lilysymptomless virus, LSV);黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV);郁金香碎錦病毒(Tulip breaking virus, TBV);異名百合斑駁病毒(Lilymottlevirus, LMoV)和百合叢簇病毒(Lilyrosettevirus,LRV)。其余9種病毒在栽培地區少量發生,對百合構不成普遍危害。目前國際上有幾個國家已經獲得百合無病毒苗，并在大規模的生產。阻斷病毒傳播獲得脫毒苗的基本方法有莖尖培養、珠芽培養、化學處理、熱處理。①莖尖培養莖尖培養脫毒的依據是病毒在患病的植株上分布不均勻，在幼嫩的或未成熟的組織和器官中病毒含量較低，而莖尖是植株中最年輕，細胞分裂最活躍的部位；病毒一般通過維管束轉移，莖尖分生組織沒有維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細胞分裂和生長的速度，所以它幾乎不含或很少含病毒。植物莖尖中無毒生長點培養，成了去除植物中病毒使植物復壯的重要方法。莖尖脫毒培養的2個關鍵技術環節是莖尖的成活率和脫毒率。莖尖培養成活率低，褐化是降低莖尖培養成活率的首要因素。褐化的發生與許多因素有關，莖尖大小、取材季節、培養方式、激素濃度、基本培養基、培養基添加物都對莖尖褐化有影響，例如莖尖越小，褐化越嚴重、成活率越低。在莖尖培養時為抑制褐化的發生，需要優化上述各因子。百合通過莖尖培養，TBV、CMV、LSV等病毒的檢出率可降至7%以下，可有效地脫除病毒。云南省農科院花卉所的研究表明，剝取O. 2 O. 3mm的莖尖成苗率可達到78%，但脫毒率僅為43%。
②珠芽培養珠芽培養時先剝掉外部鱗片，把帶有葉原基的珠芽生長點經消毒，無菌水沖洗數次后，剝掉部分葉原基，最后將帶有I 2個葉原基的生長點在解剖鏡下切成O. 3 I. 2mm不同長度小段進行培養。趙樣云等實驗表明，利用O. 3 O. 8mm珠芽生長點對淡黃花百合進行離體培養，通過脫分化產生愈傷組織，然后將愈傷組織再分化成芽，最后培育出的幼苗可成功地脫去煙草環斑病毒。③化學處理抑制植物病毒的活性化學物質包括代謝拮抗物質、植物生長調節物質等，其中一些已用于植物脫毒研究。病毒唑是廣譜性抗病毒藥物，國外在20世紀70年代末和80年代初，一些科學家將這種抗動物病毒的藥物應用于植物，成功地脫去了馬鈴薯X病毒、黃瓜花葉病毒和苜蓿花葉病毒等。實驗人員將感染了 CMV、LSV、TBV的百合鱗片接種于含病毒唑或 化影響很小。在百合生產上，采用礦物油、植物油、殺蟲劑和外激素噴灑，可控制百合病毒病蔓延。也可采用礦物油和擬除蟲菊酯殺蟲劑混合物進行噴灑，控制百合蚜蟲傳播的百合潛隱病毒和百合斑駁病毒。④熱處理熱處理依據是在高溫下病毒出現鈍化，其復制明顯減弱或不再繁殖。將植物在高溫下培養數周至數月，這個期間生長的嫩梢不帶病毒。植株的存活率和脫毒率受溫度的高低和持續時間長短的影響。大部分百合病毒在50 65°C活性穩定,所以處理溫度在65 75°C，才能鈍化病毒。但溫度過高，會降低植株的成活率。在實踐中，利用較高溫度處理時，縮短處理時間，溫度較低時適當延長處理時間。上述4種方法是脫毒常用的方法，也有將2個方法結合起來做的，比如莖尖培養和熱處理相結合來做，珠芽培養和熱處理結合來做，實驗人員就比較了化學療法和熱處理配合脫除病毒的效果。將鱗片培養在含病毒唑的培養基上，保持35°C高溫4周，脫毒效果比單獨使用化學療法或熱處理的效果好。云南省農科院花卉所的研究表明，脫毒率最好的為熱處理與莖尖培養相結合方法，大小為O. 2 O. 3mm的莖尖脫毒率為67%，大小為1_的莖尖脫毒率可達21%。
發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種減少褐化、提高成活率同時促進小鱗莖的產生龍山百合高效脫毒工藝。為解決上述問題，本發明所采用的技術方案是一種龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于步驟如下I)、預處理將采集回來的龍山百合珠芽沖洗，洗凈泥沙等雜質，再經過35°C恒溫熱處理后進行消毒；2)、第一次脫毒將恒溫熱處理后的珠芽取出，沖洗表面的雜質，剝取0.4-0. 5_大小的不帶葉原基或帶I個葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中；當誘導的小鱗莖達到一定基數的時候再進行下一步驟；
3)、第二次脫毒先將剛轉接有小鱗莖的培養基置于35°C恒溫下培養30d，以達到鈍化病毒的目的；再用解剖針剝取O. 2-0. 3mm大小不帶葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中；在光培養溫度25°C，光照強度2500Lx，待產生小鱗莖時即可轉入叢生芽誘導培養基中。4)、生根培養小鱗莖達到 一定的基數時即可轉入生根培養基中，培養約35-40d，當小鱗莖產生3-5條Icm左右的根系時就可以進行移栽。進一步地說所述的啟動培養基MS+1.5mg/L6-BA+0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 05% AC。所述的叢生芽誘導培養基l/2MS+3.0mg/L6-BA+0. lmg/L ΝΑΑ+0. 1% AC。所述生根培養基MS+0. 5mg/L NAA。更進一步地說所述步驟2)中第一次脫毒的35°C恒溫預處理的時間為5d ;步驟3)中的第二次脫毒35 °C恒溫下培養時間為30天。傳統脫毒工藝證明，小于O. 2mm的莖尖不容易培養成活，換句話說，莖尖越小，脫毒率越高，但同時成活率也越低，并認為，理論上的高成活、高脫毒的理想組培是兩者難能兼得。本發明通過多代脫毒結合熱處理保證了 100%的脫毒效率，而且突破了傳統脫毒工藝中組培苗成活率不高。應用抗氧化劑AC有效抑制莖尖培養的褐化現象。在啟動培養基中添加一定量的活性炭有效地吸附莖尖呼吸過程中產生的酚類、醛類等有毒物質，減少褐化，提高成活率。在從生芽誘導培養基中用1/2MS和較高濃度的6-BA，是為了更好地促進小鱗莖的發生，抑制葉片的生長；提高活性炭的濃度，一方面是為了減少褐化，提高成活率，另一方面也是為了造成一個黑暗的環境，從而促進小鱗莖的產生。
具體實施例方式實施例一種龍山百合高效脫毒工藝步驟如下I)、預處理將采集回來的龍山百合珠芽沖洗，洗凈泥沙等雜質，再經過35°C恒溫熱處理后進行消毒。2)、第一次脫毒將恒溫熱處理后的珠芽取出，沖洗表面的雜質，剝取O. 4-0. 5mm大小的不帶葉原基或帶I個葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中。當誘導的小鱗莖達到一定基數的時候再進行下一步驟。3)、第二次脫毒先將剛轉接有小鱗莖的培養基置于35°C恒溫下培養，以達到鈍化病毒的目的；再用解剖針剝取O. 2-0. 3mm大小不帶葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中；在光培養溫度25°C，光照強度2500Lx，待產生小鱗莖時即可轉入叢生芽誘導培養基中。4)、生根培養小鱗莖達到一定的基數時即可轉入生根培養基中，培養約35-40d，當小鱗莖產生3-5條Icm左右的根系時就可以進行移栽。上述步驟是一個系統化的步驟，適用的范圍廣。下面提供一個具體的實施步驟，針對的是湘西龍山縣當地的百合，步驟如下一、預處理I、將采集回來的百合珠芽放在自來水下沖洗lOmin，洗凈泥沙等雜質。2、將洗凈的珠芽裝在燒杯中，上面蓋一層紗布保濕，將其放在35°C恒溫箱中進行高溫鈍化處理5d。二、第一次脫毒I、將高溫鈍化后的珠芽取出，先在自來水下沖洗幾分鐘，洗去表面百合呼吸作用產生的分泌物。2、將洗凈的珠芽先用75%酒精浸泡15s后，用無菌水沖洗一次，再用O. 1%升汞處理12min，用無菌水沖洗4次，洗凈升汞殘液。3、將珠芽置于體視顯微鏡下，用解剖針剝取O. 4mm大小的不帶葉原基或帶I個葉
原基的莖尖，接種在啟動培養基中。4、培養條件在光培養溫度25°C，光照強度2500LX，培養60天左右，待產生小鱗莖 時即可轉入叢生芽誘導培養基中。5、當誘導的小鱗莖達到一定基數的時候即可進行第二次脫毒。三、第二次脫毒I、高溫預處理將剛轉接有小鱗莖的培養基置于35°C高溫下培養30d，以達到鈍化病毒的目的，一般只有10-20%的鱗莖能夠存活。2、將在高溫處理過的小鱗莖置于體視顯微鏡下，用解剖針剝取O. 3mm大小不帶葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中。培養條件同第一次脫毒。由于第二次剝取的莖尖更小，所以繼代周期會更長，一般要2-3個月，不同個體間有差異。3、叢生芽誘導當莖尖生長至產生小鱗莖時轉入叢生芽誘導培養基中，促進分化更多的小鱗莖，一個繼代周期通常需要35-40d。四、生根培養當小鱗莖達到一定的基數時即可轉入生根培養基中，培養約35-40d，當小鱗莖產生3-5條Icm左右的根系時就可以進行移栽了。經上述操作的莖尖培養成的組培苗經由湖南省蔬菜工程技術中心用分子生物學檢測，無毒率達100%,脫毒成功率為82. 8%。本發明不局限于上述最佳實施方式，任何人應該得知在本發明的啟示下做出的結構變化，凡是與本發明具有相同或者相近似的技術方案，均屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于步驟如下 1)、預處理將采集回來的龍山百合珠芽沖洗，洗凈泥沙等雜質，再經過35°C恒溫熱處理后進行消毒； 2)、第一次脫毒將恒溫熱處理后的珠芽取出，沖洗表面的雜質，剝取O.4-0. 5mm大小的不帶葉原基或帶I個葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中；當誘導的小鱗莖達到一定基數的時候再進行下一步驟； 3)、第二次脫毒先將剛轉接有小鱗莖的培養基置于35°C恒溫下培養，以達到鈍化病毒的目的；再用解剖針剝取O. 2-0. 3mm大小不帶葉原基的莖尖，接種在啟動培養基中；在光培養溫度25°C，光照強度2500Lx，待產生小鱗莖時即可轉入叢生芽誘導培養基中； 4)、生根培養小鱗莖達到一定的基數時即可轉入生根培養基中，培養約35-40d，當小鱗莖廣生3-5條Icm左右的根系時就可以進彳丁移栽。
2.根據權利要求I所述的龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于所述的啟動培養基MS+1. 5mg/L6-BA+0. 2mg/L ΝΑΑ+0. 05% AC。
3.根據權利要求I所述的龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于所述的叢生芽誘導培養基l/2MS+3. 0mg/L6-BA+0. lmg/L ΝΑΑ+0. 1% AC。
4.根據權利要求I所述的龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于所述生根培養基MS+0. 5mg/L NAA。
5.根據權利要求I所述的龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于所述步驟2)中第一次脫毒的35°C恒溫預處理的時間為5d ;步驟3)中的第二次脫毒35°C恒溫下培養時間為30天。
全文摘要
本發明公開了一種龍山百合高效脫毒工藝，其特征在于步驟如下1)預處理；2)第一次脫毒；3)第二次脫毒；4)生根培養。本發明通過多代脫毒結合熱處理保證了100％的脫毒效率，而且突破了傳統脫毒工藝中組培苗成活率不高。應用抗氧化劑AC有效抑制莖尖培養的褐化現象。在啟動培養基中添加一定量的活性炭有效地吸附莖尖呼吸過程中產生的酚類、醛類等有毒物質，減少褐化，提高成活率。在從生芽誘導培養基中用1/2MS和較高濃度的6-BA，是為了更好地促進小鱗莖的發生，抑制葉片的生長；提高活性炭的濃度，一方面是為了減少褐化，提高成活率，另一方面也是為了造成一個黑暗的環境，從而促進小鱗莖的產生。
文檔編號A01H4/00GK102870676SQ201210364720
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者顏芳燕, 周曉波, 向德高, 丁茁荑, 張治國, 吳藝飛, 白占兵 申請人:龍山縣生物科技開發公司