一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法

專利名稱：一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用耳石微量元素判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，屬于魚類生態學領域。
背景技術：
棘頭梅童魚是近海小型經濟魚類,主要分布于中西太平洋區的南海、東海和黃渤海，是我國、菲律賓、印尼、日本和朝鮮等國家沿海、河口水域重要的漁業資源和主要的經濟魚類之一。近年來由于過度捕撈和環境污染等因素的影響，棘頭梅童魚的年平均資源密度在大幅下降，資源開發率過高。其魚卵仔魚資源補充量已受到衰竭的威脅，而全人工育苗技術至今尚未成熟。近些年來由于價格不斷攀升，棘頭梅童魚已經成為一種高經濟價值的水產品。毫無疑問，準確了解棘頭梅童魚的資源動態及其與環境因子的關系，對揭示棘頭梅童魚生活史過程所需環境條件、生境規律，加強保護和優化全人工繁殖的環境技術等具有非 常重要的意義。迄今，通過漁獲調查法對棘頭梅童魚的生境及活動規律已經有了認識。它的分布區一般在河口(如長江、飛云江、閩江、珠江)，有在深淺水間洄游的現象。資源密度的變化存在季節性且隨鹽度增加而降低。產卵多在大潮水的幾天里。卵的浮性及個體發育依賴海水的鹽度等條件。然而，由于研究技術的限制，要確切而直觀地把握棘頭梅童魚從孵化到幼魚直至成魚全生活史過程中的洄游、生境差異，群體組成規律，以及不同河口水域棘頭梅童魚種群特征及相關性等尚有很大的難度。研究發現，由于不同水環境之間的元素成分會有很大的差異，魚類從水環境中吸收的元素可以在硬組織如耳石中沉積并長期保存。因此，伴隨著不同的生活和洄游履歷，硬組織中元素的積累可留下棲息水環境中元素特征的“指紋”。相應地如果能利用諸如元素衍射電子探針分析(EPMA)等較為先進的技術對這些“指紋”進行歸納總結，就有可能恢復、重現和掌握大量洄游性魚類生態學、生理學等方面的信息及其時空變化過程。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新的利用耳石微量元素判別棘頭梅童魚產地和洄游生活史的方法，通過將耳石分離、磨拋等前處理以及元素衍射電子探針分析操作等一系列步驟，測定棘頭梅童魚耳石中Sr、Ca元素的濃度值，并將這些濃度值歸納出不同生境的微量元素地理“指紋”特征，并利用這些特征來進行棘頭梅童魚產地和洄游生活史判別。鍶含量/鈣含量X IO3的比值連續出現三次及以上大于7時可判定為高鹽度生活階段；比值在3 7之間時為半咸水生活階段；比值在O 3之間時為低鹽度或淡水生活階段。該方法所取得的結果穩定性好，可重復性高、系統誤差小，可判別性強，顯示出了其快速的優勢。按照本發明提供的技術方案，一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，采用以下工藝步驟
I、捕撈不同水域的棘頭梅童魚，立刻放入清潔的塑料自封袋中并在O 4°C保存，在此溫度條件下盡快運回實驗室保存；2、野外采集并運回實驗室保存的棘頭梅童魚完整個體樣本轉移于-18 _20°C冰箱內保存，待用；3、棘頭梅童魚耳石樣本前處理方法(I)、取出左或右側矢耳石，經超純水洗清除表面的有機質，清洗干凈后，室溫下晾干、干燥保存作為分析的材料待用；(2)、用上海艾立熱熔膠棒廠生產含重量百分含量的聚氨酯膠成分>25%的熱熔膠將其較平滑的面固定在載玻片上，等熱熔膠冷卻10 15分鐘變硬后先將耳石在500目水砂紙上進行粗磨，并隨時在正置金相顯微鏡上用透反射光觀察表面狀況，待首次觀察到輪紋時換用1200目水砂紙細磨2 5分鐘使表面平滑，然后用酒精燈將熱熔膠熔化后取出耳 石；(3)、將未磨過的光面耳石用雙面膠將其固定在鑲樣模內，做好樣本標簽，將冷鑲嵌用透明的環氧樹脂和硬化劑(司特爾公司，哥本哈根，丹麥)按照5:1的比例調勻后，往每個鑲樣模內注入3 4ml混合樹脂，將耳石包埋于其中。放入40°C 45°C的干燥箱中烘12小時 15小時至完全固化；(4)、取出鑲樣模內包埋有耳石的固化樹脂塊，選用500目水砂紙對未磨過的光面耳石進行粗磨，待粘在耳石上的雙面膠全部磨掉后換用1200目水砂紙進行精磨，期間隨時在金相顯微鏡上觀察表面狀況，用透反射光確認磨至核心后，將樹脂塊洗凈待用；(5)、使用金剛石拋光液和MD拋光布以120 150rpm的轉速在拋光機上(司特爾公司，哥本哈根，丹麥)拋光3 5分鐘至耳石表面無刮痕為止。將所有拋光的樹脂塊放入超純水(美國密理博公司，Milliprore-Simplicity個人型超純水系統，出水電阻率18. 2ΜΩ. cm)中進行超聲清洗3 5分鐘后自然晾干24小時。4、棘頭梅童魚耳石樣本微區分析(I)、將耳石樣本置于JEE-420型真空鍍膜機(JEOL Ltd，Tokyo，Japan)中，在真空度達到含2x1 O^4Pa,電流達到35A 36A時，鍍碳薄膜20 25秒；(2)、從耳石核心順著最長橫軸向邊緣用電子探針顯微分析儀(日本電子公司，東京，日本，簡稱ΕΡΜΑ)進行耳石樣本的定量線分析。在測Sr、Ca元素的濃度值之前先做機器狀態校驗和標準分析，利用碳酸鈣(CaC03)、碳酸鍶(SrCO3)或鈦酸鍶(SrTiO3)等作為檢驗定量測定結果的標準物質。EPMA分析時的加速電壓參數為15KV，電子束電流為I. 2X 10_8 2.0X10_8A，速斑直徑為5μm，每點駐留時間為15秒，每間隔10 15 μ m測量下一點；(3)、由上述電子探針顯微分析儀沿耳石樣本矢狀面所獲各點定量線分析數據用Sr和Ca含量的比率值表示。每個測定點到耳石核心的距離被稱為“耳石徑”，統一使用鍶含量/鈣含量X IO3的比值表示，簡稱Sr/C a比值。耳石不同區域Sr:Ca的含量比值數據用平均值土標準差。統計分析使用美國SAS公司的StatView 5. O軟件。差異的顯著水平判定用曼-惠特尼(Mann-Whitney)U測驗進行。根據Sr:C a含量比值的顯著性差異水平，區別棘頭梅童魚的產地和不同的生活史。本發明與已有技術相比具有以下優點洄游性魚類在不同的生活史階段棲息環境可能截然不同，而準確了解這些魚類生活史過程中的生境變化非常困難，因為不管是傳統的捕撈調查法，還是現在的生物遙測(biotelemetry)法均無法解決“多種類泛用”、“非負荷”、“全生活史監測”這三大難題。本發明選用江蘇省長江口相同采樣地不同年份和廣東省珠江口產棘頭梅童魚耳石作為判別對象，經一系列標準化的前處理方法，獲得清晰的磨至核心的耳石樹脂塊再鍍上碳薄膜后，即可運用大型精密分析儀器電子探針顯微分析儀(簡稱EPMA)，利用碳酸鈣、碳酸鍶或鈦酸鍶作為定量分析的標準樣品，完成標準分析之后，即可精確地測定耳石中目標元素Sr和Ca的濃度，根據Sr:Ca含量比值的顯著性差異水平，可較為快速地區分不同階段和不同水域棘頭梅童魚的洄游規律和生活史特征。該方法所取得的結果穩定性好，可重復性高、系統誤差小，可判別性強，不僅克服了捕撈調查法、生物遙測法等方法無法判別的局限，而且具有快速檢測、精確判定的優勢，可有效區別不同產地和不同生活史的棘頭梅童魚。


圖I為本發明珠江口十五涌水域棘頭梅童魚耳石樣本沿耳石矢狀面從核心(Oym)到邊緣定量線分析記錄到的Sr:C a含量比率變化。
圖2為本發明2010年夏季長江口崇明水域棘頭梅童魚耳石樣本沿耳石矢狀面從核心(Ομπι)到邊緣定量線分析記錄到的Sr:Ca含量比率變化。圖3為本發明2010年春季長江口崇明水域棘頭梅童魚耳石樣本沿耳石矢狀面從核心(Ομπι)到邊緣定量線分析記錄到的Sr:Ca含量比率變化。
具體實施例方式下面本發明將結合實施例作進一步描述實施例一一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，采用以下工藝步驟(I) ,2011年11月采自珠江口十五涌水域棘頭梅童魚的樣本先放入清潔的塑料自封袋中并在O 4 C保存并盡快運回實驗室；(2)、取體長規格接近的樣本分類放于_20°C冰箱內保存隨用。解凍后取體長大于13厘米樣本的右側矢耳石，超純水洗清除耳石表面的有機質并自然晾干24小時后作為分析的材料待用；(3)、用上海艾立熱熔膠棒廠產熱熔膠將其較平滑的面固定在載玻片上，等熱熔膠冷卻10分鐘變硬后先將耳石在500目水砂紙上進行粗磨，并隨時在C2030B正置金相顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)上用透反射光觀察表面狀況，待首次觀察到輪紋時換用1200目水砂紙細磨2分鐘使表面平滑，然后用酒精燈將熱熔膠熔化后取出耳石；(4)、將未磨過的光面耳石用雙面膠將其固定在鑲樣模(25mm直徑)內，做好樣本標簽，將將冷鑲嵌用透明的環氧樹脂和硬化劑(司特爾公司，哥本哈根，丹麥)按照5:1的比例調勻后，往每個鑲樣模內注入3ml混合樹脂，將耳石包埋于其中。放入45°C的干燥箱中烘12小時至完全固化；(5)、取出鑲樣模內包埋有耳石的固化樹脂塊，選用500目水砂紙對未磨過的光面耳石進行粗磨，待粘在耳石上的雙面膠全部磨掉后換用1200目水砂紙進行精磨，期間隨時在金相顯微鏡上觀察表面狀況，用透反射光確認磨至核心后，將樹脂塊洗凈待用；(6)、使用金剛石拋光液和MD拋光布以150rpm的轉速在Roto Pol_35型(司特爾公司，哥本哈根，丹麥)拋光機上拋光3分鐘至耳石表面無刮痕為止。將所有拋光的樹脂塊放入超純水(美國密理博公司，Milliprore-Simplicity個人型超純水系統，出水電阻率18. 2ΜΩ. cm)中進行超聲清洗5分鐘后自然晾干24小時；(7)、將耳石樣本置于JEE-420型真空鍍膜機(JEOL Ltd，Tokyo，Japan)中，在真空度達到蘭2x1 O^4Pa,電流達到35A時，鍍碳薄膜20秒；(8)、從耳石核心順著最長橫軸向邊緣用電子探針顯微分析儀JXA-8100型(日本電子公司，東京，日本)進行耳石樣本的定量線分析。在測Sr、Ca元素的濃度值之前先做機器狀態校驗和標準分析，利用碳酸鈣(CaCO3)和鈦酸鍶(SrTiO3)作為檢驗定量測定結果的標準物質。EPMA分析時的加速電壓參數為15KV，電子束電流范圍為2. OX 10_8A，速斑直徑為5 μ m，每點駐留時間為15秒，每間隔10 μ m測量下一點；將上述電子探針顯微分析儀沿耳石標本矢狀面所獲各點定量線分析數據整理成圖I、表I和表3，標本號為GZCL1、GZCL4、GZCL5和GZCL6。由圖I可知珠江口水域棘頭梅 童魚耳石絕大部分Sr :CaX IO3的比值在3_7之間窄幅波動，核心區沒有出現驟降現象，生活史階段劃分不明顯；表1顯示耳石核心(Oym)到邊緣定量線分析Sr:Ca含量比率的平均值，雖然個體之間的洄游方式略有差異，即平均值有高有低，但并未出現長江崇明口水域棘頭梅童魚耳石兩階段鍶(Sr):鈣(Ca) X IO3值的現象；表3的曼-惠特尼U測驗表面廣州珠江口十五涌水域棘頭梅童魚耳石的鍶(Sr):鈣(Ca) X IO3值與長江口崇明水域的差異水平極其顯著。因此利用本發明所獲得數據可以較客觀地區別不同產地的棘頭梅童魚群體和其生活史階段劃分，判別效果良好。實施例二 一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，采用以下工藝步驟(I)、2010年夏季采自長江口崇明水域棘頭梅童魚的樣本先放入清潔的塑料自封袋中并在O 4°C保存并盡快運回實驗室；(2) (8)同實施例一樣本前處理及測試步驟，因耳石較大，每間隔15 μ m測量下一點。將上述分析數據整理成圖2、表2和表3，樣本號為SCLl和SCL2。由圖2可知長江口崇明水域夏季棘頭梅童魚耳石明顯可分為2個階段，即耳石核心部的Sr:CaX IO3比均很高，之后直到捕獲，SriCaXlO3的比值絕大部分在3_7之間窄幅波動，在孵化階段轉向發育和生長階段時，SriCaXlO3的比值出現驟降現象，群體的生活史階段劃分明顯，個體之間的洄游方式大致相同；表2亦顯示耳石核心(Ομπι)到邊緣定量線分析Sr:Ca含量比率的值出現兩階段現象；表3的曼-惠特尼U測驗表明夏季長江口崇明水域棘頭梅童魚耳石鍶(Sr):鈣(Ca) X IO3值與廣州珠江口十五涌水域的差異水平極其顯著。同樣證明了利用本發明所獲得數據可以較客觀地區別不同產地的棘頭梅童魚群體和其生活史階段劃分，判別效果良好。實施例三本發明一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，采用以下工藝步驟(I)、2010年春季采自長江口崇明水域棘頭梅童魚的樣本先放入清潔的塑料自封袋中并在O 4°C保存并盡快運回實驗室；(2) (8)同實施例二樣本前處理及測試步驟。將上述分析數據整理成圖3、表2和表3，樣本號為CL2、CL3、CL4和C L10。由圖3可知長江口崇明水域春季棘頭梅童魚耳石明顯可分為2個階段，即耳石核心部的Sr:CaX IO3比均很高，之后直到捕獲，Sr = CaXlO3的比值絕大部分在3_7之間窄幅波動，在孵化階段轉向發育和生長階段時，SriCaXlO3的比值出現驟降現象，群體的生活史階段劃分明顯，個體之間的洄游方式大致相同；表2亦顯示耳石核心(Ομπι)到邊緣定量線分析Sr:Ca含量比率的值出現兩階段現象；表3的曼-惠特尼U測驗表明春季長江口崇明水域棘頭梅童魚耳石鍶(Sr):鈣(Ca) X IO3值與廣州珠江口十五涌水域的差異水平極其顯著。同樣證明了利用本發明所獲得數據可以較客觀地區別不同產地的棘頭梅童魚群體和其生活史階段劃分，判別效果良好。表I廣州珠江口十五涌水域棘頭梅童魚耳石的鍶(Sr):鈣(Ca) X IO3值
權利要求
1.一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，其特征是采用以下工藝步驟 (1)、野外采集不同水域的棘頭梅童魚樣本先放入清潔的塑料自封袋中，并在O 4°C保存，在此溫度條件下盡快運回實驗室保存； (2)、野外采集并運回實驗室保存的棘頭梅童魚，取體長規格接近的樣本轉移于-18 _20°C冰箱內保存，待用； (3)、棘頭梅童魚耳石樣本前處理方法 (3-1)、取出樣本左或右側矢耳石解凍后，經超純水清除表面的有機質，清洗干凈后，室溫下晾干、干燥保存作為分析的材料待用； (3-2)、取含聚氨酯膠成分>25%的熱熔膠將耳石平滑的面固定在載玻片上，等熱熔膠冷卻10 15分鐘變硬后，先將耳石在500目水砂紙上進行粗磨，并隨時在正置金相顯微鏡上用透反射光觀察表面狀況，待首次觀察到輪紋時換用1200目水砂紙細磨2 5分鐘使表面平滑，然后用酒精燈將熱熔膠熔化后取出耳石； (3-3)、將未磨過的光面耳石用雙面膠將其固定在鑲樣模內，做好樣本標簽，將冷鑲嵌用透明的環氧樹脂和硬化劑的質量比為5:1的比例調勻后，往每個鑲樣模內注入3 4 ml混合樹脂溶液，將耳石包埋于其中；放入40°C 45°C的干燥箱中烘12小時 15小時至完全固化； (3-4)、取出鑲樣模內包埋有耳石的固化樹脂塊，選用500目水砂紙對未磨過的光面耳石進行粗磨，待粘在耳石上的雙面膠全部磨掉后換用1200目水砂紙進行精磨，期間隨時在金相顯微鏡上觀察表面狀況，用透反射光確認磨至 核心后，將樹脂塊洗凈待用； (3-5)、使用金剛石拋光液和MD拋光布以120 150rpm的轉速在拋光機上拋光3 5分鐘至耳石表面無刮痕為止；將所有拋光的樹脂塊放入超純水環境中進行超聲清洗3 5分鐘后，自然晾干24小時為耳石樣本； (4)、棘頭梅童魚耳石樣本微區分析 (4-1)、將耳石樣本置于真空鍍膜機中，在真空度達到=2x1 O^4Pa,電流達到35A 36A時，鍍碳薄膜20 25秒； (4-2)、從耳石樣本核心順著最長橫軸向邊緣用電子探針顯微分析儀進行耳石樣本的定量線EPMA分析；在測Sr、Ca元素的濃度值之前先做機器狀態校驗和標準分析，利用碳酸鈣、碳酸鍶或鈦酸鍶作為檢驗定量測定結果的標準物質； (4-3)、由上述電子探針顯微分析儀沿耳石樣本矢狀面所獲各點定量線分析數據用Sr和Ca含量的比率值表示；每個測定點到耳石核心的距離被稱為耳石徑，統一使用鍶含量/鈣含量X IO3的比值表示，簡稱Sr/Ca比值；耳石不同區域Sr: Ca的含量比值數據用平均值土標準差進行統計分析；差異的顯著水平判定用曼-惠特尼U測驗進行；根據Sr: Ca含量比值的顯著性差異水平，區別棘頭梅童魚的產地和不同的生活史。
2.如權利要求I所述的一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，其特征是所述步驟(3)中鑲樣模直徑為25mm。
3.如權利要求I所述的一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，其特征是所述步驟(3)中超純水系統出水電阻率18. 2ΜΩ. cm。
4.如權利要求I所述的一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，其特征是所述步驟(4)中EPMA分析時的加速電壓參數為15KV，電子束電流為I. 2X 10_8 2. OX 10_8Α，速斑 直徑為5 μ m,每點駐留時間為15秒，每間隔10 15 Mm測量下一點。
全文摘要
本發明涉及一種判別棘頭梅童魚產地和生活史的方法，特征是取樣本分類放于冰箱內保存待用；標本解凍后取左或右側矢耳石用水清除耳石表面的有機質并自然晾干；先用熱熔膠固定耳石，再用混合樹脂調勻后包埋耳石，雙面磨制耳石；用透反射光確認磨至核心后，經拋光、清洗、鍍碳薄膜后方可用X射線電子探針微區分析儀進行耳石樣品的定量線分析；以及分析時確定的各狀態參數都保證了所取得的結果穩定性好，可重復性高、系統誤差小，可判別性強，克服了目視、遺傳學等方法無法判別的局限，亦可有效區別不同產地的棘頭梅童魚群體和其生活史階段劃分。該方法同樣為了解其它洄游魚類的生活史規律提供了便利。
文檔編號A01K61/00GK102792912SQ201210330300
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者楊健, 劉洪波, 姜濤 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心