專利名稱：一種黃精的組織培養方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養方法，具體地說是黃精的組織培養方法。
背景技術：
黃精(Polygonaturm sibiricum Redoute)別名雞頭黃精、雞頭參，屬于百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物。中藥以黃精根莖入藥,具有補脾潤肺、益氣養陰、強壯筋骨等功效，能治療體虛乏力、心悸氣短、肺燥干咳、病后體虛、風濕痛疼、糖尿病等疾病，其活性成分主要為黃精多糖及皂甙等。地藏黃精是安徽九華山地區特有的野生黃精品種，有著極高的藥用和經濟價值， 隨著黃精藥用價值和保健價值越來越被人們認識，黃精原料的需求量也越來越大，致使野生黃精的無計劃采集加劇，導致其資源枯竭加速，影響可持續開發利用。因此，為了保證黃精原料來源、實行產業化種植將成為必然趨勢。近年來雖然有些地方開始人工種植黃精，但由于生產上多采用分根繁殖，其繁殖系數低，質量不穩定，故黃精種苗問題成了人工大面積種植的瓶頸。植物的離體快速繁殖，是目前植物組織培養中應用最廣泛、最有效的技術，尤其對于新引進品種、脫毒苗、優良單株、瀕危植物和基因工程植株等可實現離體快速增殖，且不受地區、氣候影響，繁殖速度比常規生產快數百萬倍，能迅速提供大量優質種苗。目前，人們對黃精的研究主要集中在其成分測定、藥理作用以及人工栽培等方面，而關于組織培養方面的研究內容較少。
發明內容
本發明的目的在于提供一種黃精的組織培養方法，通過該方法可以對黃精進行快速繁殖，并實現大面積工業化種植，以解決野生地藏黃精產量低、供應少和自然栽培周期長的問題。本發明解決技術問題采用如下方案( I)外植體的選擇與滅菌選擇當年生地下莖上的幼芽或當年生帶有隱藏芽點的的塊莖部分，所述塊莖將其切成小塊，且每塊都帶有至少一個隱藏的芽點；將所述幼芽或塊莖用自來水快速沖去泥沙，并用洗滌劑液浸泡30min以除去表面污垢，然后自來水沖洗3h，再置于超凈工作臺用體積濃度75%酒精滅菌15s，無菌水沖洗3遍，再將其放入體積濃度0. 2%Hgcl2溶液中浸泡12-14min，所述Hgcl2溶液中包含有體積濃度0. 15%-02%的吐溫20，之后無菌水沖洗5遍，轉入培養皿中吸干水分，等待接入培養基；(2)幼芽叢生芽的誘導、塊莖叢生芽愈傷組織培養和增殖培養A、將經過步驟(I)處理的幼芽轉入叢生芽誘導培養基中，所述叢生芽誘導培養基的配方為MS+6-BA 4. Omg/L+NAAO. 2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8 ;培養條件為溫度23±1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為20-30天；然后直接轉入生根培養；B、①將經過步驟(I)處理的帶有隱藏芽點的的塊莖接種MS+6-BA 4. Omg/L+NAA0. 2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8 培養基上，23± 1°C、光照 1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為20-30天；中間剔除污染的塊莖外植體；②在塊莖組織分化形成愈傷組織后，轉入培養基為MS+6-BA 3. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH 5. 8 ;培養條件為溫度23±1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為10-20天；愈傷組織進行增殖，將增殖后的愈傷組織切成I. 0cm*I. 0cm*I. Ocm大小然后轉入原先的誘導培養基MS+6-BA 4. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5. 8培養基上，23±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為15-25天;(3)生根的培養將經過步驟(2)處理的外植體轉入生根培養基中培養，所述生根培養基的配方為 l/2-l/3MS、NAA 0. 2-0. 5mg/L、瓊脂 6_8g/L、蔗糖 20_30g/L ;培養條件為溫度 23±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為35-50天；(4)煉苗和移栽將經過煉苗的黃精根莖從接種瓶中取出，用清水洗掉培養基，在質量濃度0. 1%高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在腐殖質土 沙子=1:1 (v :v)的基質上，保持空氣濕度95%以上，用遮陽網遮蔭；根據成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的黃精根莖栽種到整好的露地畦內，將根莖段芽眼向上，每隔10 15cm平放I個根莖，行距20 25cm，覆土 4 6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機肥或薄膜，以利保暖越冬。本發明方法中，采用不同營養體作為材料，既保證了遺傳的穩定性，又增加了原材料利用的可能性。利用芽直接分化成葉片，然后進行成苗階段，縮短了原先用芽經過誘導愈傷組織再分化成苗階段的時間，同時利用塊莖分化并增殖，大大提高繁殖的效率和數量，而對于不同部位消毒方法的不同，不僅降低了污染率也保證了較高的成活率，從而滿足大規模推廣和工廠化生產的要求。本發明方法具有如下優點或效果I.本方法采用的黃精材料是安徽特有的野生品種，有極高的藥用價值，而本方法可以適合工廠化使用，解決野生產量較少的問題，同時通過不同部位不同的培養方式多方面的對材料進行擴大和快速培養，提高材料的利用率的同時縮短培育時間，而且保證了較高的成活率。2.本方法改進了常用的繁殖方法如選擇和常用方法不一樣的取材部位，針對不同的取材部位采取不同的滅菌方式。針對不同部位的質地不同采用不同濃度的表面活性劑吐溫20，使得消毒溶液Hgcl2能有效的滲透表層，改善之前的消毒效果不佳的狀況，提高消毒的效率，從而大大提高無菌率和成活率。在此過程中因為莖段芽選取的是去除外層較厚苞片的最內層幼芽(一般成乳白色)，所以需要表面活性劑的加入，提高滅菌效果，但是由于芽的組織選取的比較幼嫩，所以活性劑的量減少，達到即加強滲透效果又不損傷幼芽，而對于塊莖組織，為堅硬的肉質結構，為了達到好的滅菌效果，所以增加吐溫20的濃度，兩種不同的取材選擇不同的滅菌方式是為了在不傷害組織本身都能到達理想的滅菌效果。3.本方法采用的誘導培養基對于莖段芽組織進行直接誘導分化形成葉片，而不需要通過先誘導愈傷組織再進行分化的長時間過程，大大縮短了成苗時間，對于野生黃精的資源利用，快速繁殖有極大的作用。4.本方法在對于塊莖培養的過程中采用了與前人不同的循環路徑，即先將塊莖在誘導培養基中進行培養，快速誘導出愈傷組織后立即轉入增殖培養基進行增殖，將增殖后的材料再切分成I. 0cm*l. 0cm*l. Ocm的大小接入原先的誘導培養基進行接下來的誘導分化培養，在兩次誘導培養中間加入增殖的部分，這樣做可以大大提高最終誘導產生的實驗苗的數量，從而獲得較大量的成苗，也可以一定程度上縮短常規成苗的時間。5.本方法在前期誘導的過程中采用一種培養基對不同材料產生兩種不同的誘導結果，可以節約配置不同實驗材料所需的時間，能提高材料的利用率。6.本方法中的組培苗營養充足、溫光合理，長勢旺盛。
具體實施方式
以下通過具體實施例對本發明技術方案做進一步說明。以下實施例MS培養基配方每升培養基中含KN03( 1900mg/L), NH4NO3C 1650mg/L),MgSO4 *7H20 (370mg/L),KH2PO4 (170mg/L),CaCl2 (330mg/L)，KI (0. 83mg/L), H3BO3 (6. 2mg/L), MnSO4 .H2O (16. 9mg/L), ZnSO4 *4H20 (8. 6mg/L), CuSO4 *5H20 (0. 025mg/L) , CoCl2 *6H20(0. 025mg/L)，Na2MoO4 2H20 (0. 25mg/L)，FeSO4 7H20(27. 85mg/L)，Na2EDTA (37. 25mg/L)，甘氨酸(2. Omg/L),煙酸B3 (0. 5mg/L)，鹽酸硫胺素BI (0. 4mg/L)，鹽酸批卩多醇B6 (0. 5mg/L),肌醇(lOOmg/L) o實施例I( I)外植體的選擇與滅菌選擇地藏黃精的當年生地下莖上的幼芽，將幼芽從土中挖出切取幼芽，自來水快速沖去泥沙，可用牙刷輔助沖洗，洗滌劑液(市售常規洗衣粉)浸泡30min并用軟刷輕輕刷去表面污垢，將外層苞片去除，留下最內層乳白色幼芽，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上體積濃度75%酒精溶液滅菌15s，之后無菌水沖洗3遍，體積濃度0. 2%Hgcl2, Hgcl2溶液中包含有體積濃度0. 15%的吐溫20，浸泡12min，無菌水沖洗5遍，轉入培養皿中吸干水分等待接入培養基；混合了吐溫20后的Hgcl2溶液消毒效果比原先沒有混合的溶液無菌率提高T 10 倍。(2)莖段芽的誘導分化將莖上幼芽接種 MS+6-BA 4. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8培養基上，23± I°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，5周后直接分化形成葉片。誘導率達到了 81%。(3)生根的培養從中選取生長健壯，葉片展開，長度適中的誘導分化幼芽，轉入以1/3MS+NAA 0. 6mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L pH 5. 8 ;培養條件為溫度23±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為7-10天；在3次重復處理，每次處理3組，每組9株的實驗中，平均每個外植體生根7. 9條。(4)煉苗與移栽將生根后的成苗每隔25-30天重新轉入生根培養基，如此反復2-3次，這樣的成苗質量優良，能經受外界環境帶來的影響。將壯苗后的成苗瓶口打開，在培養室半遮光放置2-3日，期間適時補充水分，使組培苗逐步適應外界環境，達到煉苗的目的。將經過煉苗的黃精從接種瓶中取出，用清水洗掉培養基，在質量濃度0. 1%高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在基質[V(腐殖質土)V(沙子)一1 1]上，保持空氣濕度95%以上，用遮光率75%遮陽網遮蔭。30d后假植成活率達90%以上。以后每隔7d噴施I次MS營養液。為了縮短培育時間，根據成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的黃精根莖栽種到整好的露地畦內，將根莖段芽眼向上，每隔10 15cm平放I個根莖，行距20 25cm，覆土 4 6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機肥或薄膜，以利保暖越冬；成活率達 80%。實施例2(2)外植體的選擇與滅菌 選擇地藏黃精的當年生(即栽植后第一年生長出來的)帶有隱藏芽點的的塊莖部分，塊莖先切成I. Ocm3左右的小塊，且每塊都必須帶有至少一個隱藏的芽點，自來水快速沖去泥沙，可用牙刷輔助沖洗，洗滌劑液浸泡30min并用軟刷輕輕刷去表面污垢，自來水沖洗3h，置于超凈工作臺上體積濃度75%酒精溶液滅菌15s，之后無菌水沖洗3遍，體積濃度0. 2%Hgcl2, Hgcl2溶液中包含有體積濃度0. 2%的吐溫20，浸泡14min，無菌水沖洗5遍；轉入培養皿中吸干水分等待接入培養基。混合了吐溫20后的Hgcl2溶液消毒效果比原先沒有混合的溶液無菌率提高了 10倍。(2)塊莖的的分化增殖培養I)將帶有隱藏芽點的的塊莖接種MS+6-BA 4. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5. 8培養基上，23± I°C、光照1500_2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為20-30天；中間剔除污染的外植體。81組平行試驗中，I周后每個塊莖外植體長出愈傷組織，但是在不轉入增殖培養基一直在分化培養基中6周后外植體也可獲得平均9. 8個不定芽，所需時間較長，且最終產量不高。 2 )在塊莖組織分化形成愈傷組織后，轉入培養基為MS+6-BA 3. Omg/L+NAA0. 2mg/L+瓊脂 7g/L+蔗糖 30g/L，pH 5. 8 ;培養條件為溫度 23±1°C、光照 1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為10-20天。愈傷組織進行增殖，進行接下來的誘導分化培養，將增殖后的愈傷組織切成I. 0cm*I. 0cm*I. Ocm大小然后再轉入原先的誘導培養基MS+6-BA 4. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8 培養基上，23± 1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為15-25天。最終發現不定芽數量提高了 12倍左右，大大提高了組培苗量。同時也縮短了整個培育時間。(3)生根的培養從中選取生長健壯，葉片展開，長度適中的組織，切除多余的愈傷組織，轉入以1/3MS+NAA 0. 6mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L pH 5. 8 ;培養條件為溫度23土1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為7_10天。在3次重復處理，每次處理3組，每組9株的實驗中，平均每個外植體生根7. 7條。(4)煉苗與移栽生根后的成苗每隔25-30天重新轉入生根培養基，如此反復2-3次，這樣的成苗質量優良，能經受外界環境帶來的影響。將壯苗后的成苗瓶口打開，在培養室半遮光放置2-3日，期間適時補充水分，使組培苗逐步適應外界環境，達到煉苗的目的。
將經過煉苗的黃精從接種瓶中取出，用清水洗掉培養基，在質量濃度0. 1%高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在基質[V(腐殖質土)V(沙子)一1 1]上，保持空氣濕度95%以上，用遮光率75%遮陽網遮蔭。30d后假植成活率達90%以上。以后每隔7d噴施I次MS營養液。為了縮短培育時間，根據成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的黃精根莖栽種到整好的露地畦內，將根莖段芽眼向上，每隔10 15cm平放I個根莖，行距20 25cm，覆土 4 6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機肥或薄膜，以利保暖越冬；成活率達 75%。綜合以上各實驗步驟，本發明的方法，在現有黃精、地藏黃精組織培養技術的基礎上添加了莖段芽直接誘導分化和塊莖組織培養過程。在增加的材料的利用率的同時對于不同的材料選擇不同的處理方法，能夠提高誘導率的同時增加增殖數量和質量，從而適合大規模的工廠化生產，解決原材料稀缺的問題，縮短的培育周期，使材料可以發揮更大的藥用 和經濟價值。
權利要求
1.一種黃精的組織培養方法，其特征在于該方法按如下步驟進行 (1)外植體的選擇與滅菌 選擇當年生地下莖上的幼芽或當年生帶有隱藏芽點的的塊莖部分，所述塊莖將其切成小塊，且每塊都帶有至少一個隱藏的芽點； 將所述幼芽或塊莖用自來水快速沖去泥沙，并用洗滌劑液浸泡30min以除去表面污垢，然后自來水沖洗3h，再置于超凈工作臺用體積濃度75%酒精滅菌15s，無菌水沖洗3遍，再將其放入體積濃度0. 2%Hgcl2溶液中浸泡12-14min，所述Hgcl2溶液中含有體積濃度0.15%-02%的吐溫20，之后無菌水沖洗5遍，轉入培養皿中吸干水分，等待接入培養基； (2)幼芽叢生芽的誘導、塊莖叢生芽愈傷組織培養和增殖培養 A、將經過步驟(I)處理的幼芽轉入叢生芽誘導培養基中，所述叢生芽誘導培養基的配方為MS+6-BA 4. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8 ;培養條件為溫度23土 1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為20-30天；然后直接轉入生根培養； B、①將經過步驟(I)處理的帶有隱藏芽點的的塊莖接種MS+6-BA4. Omg/L+NAA0.2mg/L+ 瓊脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，pH=5. 8 培養基上，23± 1°C、光照 1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為20-30天；中間剔除污染的塊莖外植體；②在塊莖組織分化形成愈傷組織后，將誘導出的的愈傷組織轉入培養基為MS+6-BA 3. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH 5. 8 ;培養條件為溫度23±1°C、光照1500-2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為10-20天；愈傷組織進行增殖，然后將增殖后的愈傷組織切成1.0cm*I. 0cm*I. Ocm大小，再轉入原先的誘導培養基MS+6-BA 4. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+瓊脂7g/L+蔗糖30g/L，pH=5. 8培養基上，23± 1°C、光照1500_2000Lx ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為15-25天； (3)生根的培養 將經過步驟(2)處理的外植體轉入生根培養基中培養，所述生根培養基的配方為l/2-l/3MS、NAA 0. 2-0. 5mg/L、瓊脂 6_8g/L、蔗糖 20_30g/L ;培養條件為溫度 23±1°C、光照1500-2000LX ;光照時間為10-12小時/天，培養時間為35-50天； (4)煉苗和移栽 將經過煉苗的黃精根莖從接種瓶中取出，用清水洗掉培養基，在質量濃度0. 1%高錳酸鉀溶液中消毒lmin，用清水沖洗干凈后，假植在腐殖質土 沙子=1:1 (v v)的基質上，保持空氣濕度95%以上，用遮陽網遮蔭；根據成苗的時間安排栽植，在春季以后成苗則選擇秋栽即9-10月下旬，在春季之前成苗則選擇春栽即3月下旬，將假植的黃精根莖栽種到整好的露地畦內，將根莖段芽眼向上，每隔10 15cm平放I個根莖，行距20 25cm，覆土 4 6cm，澆足水；在土壤封凍前，畦面上蓋一層有機肥或薄膜，以利保暖越冬。
全文摘要
本發明公開了一種黃精的組織培養方法，對當年生地下莖上的幼芽進行叢生芽誘導、生根培養、煉苗后進行移栽；對當年生帶有隱藏芽點的塊莖部分進行愈傷組織培養、增殖培養、生根培養、煉苗后進行移栽，通過該方法可以對黃精進行快速繁殖，并實現大面積工業化種植，以解決野生地藏黃精產量低、供應少和自然栽培周期長的問題。
文檔編號A01H4/00GK102771395SQ20121028656
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者任潔, 湯鋒, 沈周高, 王進, 趙華琳, 項艷 申請人:安徽農業大學