一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法

一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法
【專利摘要】本發明提供了一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法，收集方法包括如下步驟：將沙子放入能封口的多孢分離收集容器中，滅菌、干燥；選用蛹蟲草子囊果發育成熟的子實體，放入有沙子的多孢分離收集容器中；振蕩多孢分離收集容器，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。將收集到的沙子置于干燥無菌容器中密封，室溫避光或冰箱冷藏保存。本發明提供的收集方法操作簡單、提高了子囊孢子的收集率，保存的子囊孢子活化后能夠保留蛹蟲草原始親本的遺傳性狀，并用于篩選抗逆新品種。
【專利說明】一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛹蟲草栽培【技術領域】，具體地，涉及一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法。
【背景技術】
[0002]蛹蟲草Cordyceps militaris (L.ex Fr)Link,又名北冬蟲夏草、北蟲草，寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲蛹體上。生長在低海拔的平原地域，主要分布在東北、華北、西北等地。現代研究表明，蛹蟲草含有蟲草素(3’_脫氧腺苷)、蟲草酸(D-甘露醇)、腺苷、蟲草多糖、麥角留醇、超氧化物歧化酶(S0D)、硒(Se)等化學成分。具有提高人體免疫功能、抗癌、抗菌、抗疲勞、抗衰老、抗驚厥、耐缺氧、鎮靜、壯陽固腎等作用。同時還具有減肥、瘦身、美容等功效。
[0003]近年來，很多研究都表明，人工栽培的蛹蟲草化學成分及藥理作用與冬蟲夏草相似，但價格卻遠遠低于冬蟲夏草，因此，蛹蟲草的開發應用具有極大的潛在市場。人工培養蛹蟲草要得到子實體，關鍵是該蛹蟲草菌株要有形成子實體的能力，不同菌株所具備的遺傳背景是不一樣的，所以它們具備形成的子實體的能力有差異。然而，在實際生產中，即使是優勢蛹蟲草菌株，隨著菌種傳代、轉接次數的增加或保藏時間的延長，菌種資源極易退化。
[0004]孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無性孢子萌發成菌絲，培養成菌種的方法。這種菌種生活力較強，但孢子個體之間有差異，且自然分化現象較嚴重，變異大，需經出菇試驗才能在生產上應用。目前的孢子分離法主要有:(一)單孢分離法:是每次或每支試管只取一個擔孢子，讓它萌發 成菌絲體來獲得純菌種的方法。單孢分離生產上較少采用，而且技術復雜，一般采用多孢分離法。(二)多孢分離法是把許多孢子接種在同一培養基上，讓它們萌發、自由交配來獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種:1.種菇孢子彈射法:選擇適應性強的八九分成熟的種菇，菌柄用無菌水沖洗數遍后再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無菌室內，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養皿上面；上端小孔用棉花塞住。培養皿放在一個鋪有紗布的搪瓷盤上，靜置12~20小時，菌褶上的孢子就會散落在培養皿內。形成一層粉末狀孢子印。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養皿上劃線接種。待孢子萌發，生成菌落時，選孢子萌發早、長勢好的菌落進行試管培養。還可用孢子采集器收集孢子。按上述程序，輕輕掀開玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上，放在培養皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鐘掌周圍塞好。并在紗布上倒少許升汞或無菌水。移入20°C左右恒溫箱培養。2.褶上涂抹法:選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實體尚未彈射的孢子，再在培養基上劃線接種。3.鉤懸法:取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳)，用無菌不銹鋼絲(或鐵絲、棉線等其他懸掛材料)懸掛于三角瓶內的培養基的上方，勿使接觸到培養基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養、轉接即可。4.貼附法:將成熟的菌褶或耳片取一小塊，用溶化的瓊脂培養基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養基正上方的試管壁上。經6~12小時的培養，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養基移植到新的試管中培養即可。孢子分離得到的母種、進一步提純復壯，當母種定植一周左右，菌絲布滿斜面時，選擇菌絲健壯、生長旺盛無老化、無感染雜茵的母種試管，進而轉管擴大。孢子分離得到的母種，必須通過出菇試驗，鑒定為優質菌種后，才可供生產使用。上述方法存在兩個不足:第一，操作復雜。第二，只能收集成熟的被彈射出的孢子，而成熟的卻沒被彈射出的成熟孢子卻不能收集到。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種蛹蟲草子囊孢子的收集和保存方法，以克服上述不足。
[0006]為了實現本發明目的，本發明的一種蛹蟲草子囊孢子的收集方法，其包括如下步驟:
[0007]I)將沙子放入能封口的多孢分離收集容器中，滅菌、干燥；
[0008]2)蛹蟲草子囊果發育成熟的子實體放入步驟I)中的多孢分離收集容器中；
[0009]3)振蕩多孢分離收集容器，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。
[0010]其中，所述步驟I)沙子為中性干燥沙子，其通過如下方法獲得:
[0011]a)將河沙過60目篩，棄去大顆粒及雜質；
[0012]b)再用80目過篩，棄去細沙，收集未過篩的沙子；
[0013]c )去除沙子中的鐵質；
`[0014]d)用10%_20%的鹽酸浸泡沙子24h后，倒去鹽酸，用水洗泡至中性，烘干沙子。
[0015]進一步地，步驟c)中可使用吸鐵石除去沙子中的鐵質。
[0016]本發明使用的多孢分離收集容器，可以為任意形狀的可密封的玻璃容器或金屬容器。
[0017]其中，步驟I)所述的沙子放入能封口的多孢分離收集容器中的放置方法是將等質量的沙子與蒸餾水混合后，按體積比1:3-10置于多孢分離收集容器中。
[0018]其中，步驟I)所述的滅菌是121°C,濕熱滅菌30min。
[0019]其中，步驟I)所述的干燥是80°C干燥24_48h。
[0020]上述滅菌和干燥的步驟中，多孢分離收集容器均嚴格封口進行滅菌和干燥。
[0021]其中，步驟2)蛹蟲草子囊果發育成熟的子實體優選l_2cm子囊果豐富的子實體頭部，放入步驟I)中的多孢分離收集容器中，室溫放置10-30天，至子實體完全干燥。
[0022]其中，步驟2)所述的子實體放入多孢分離收集容器中，放入的子實體條數與容器中沙子的個數質量比為I條:2.5-5g。
[0023]在本發明提供的蛹蟲草子囊孢子收集方法的步驟2)中，室溫放置10-30天，直至子實體完全干燥。在這期間，一部分成熟的子囊果會自然彈射子囊孢子到細沙上，有部分成熟的子囊果尚未彈射子囊孢子就干燥了，還有一部分未完全成熟的子囊果沒有進入彈射時期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果內。
[0024]其中，步驟3)所述的振蕩是將多孢分離收集容器以80-200r/min轉速振蕩24-48h。
[0025]本發明提供的一種蛹蟲草子囊孢子的收集方法還包括將干燥的子實體取出。[0026]本發明還提供一種蛹蟲草子囊孢子的保存方法，將上述方法獲得的含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子置于干燥無菌容器中密封保藏。
[0027]進一步地，本發明保存蛹蟲草子囊孢子的保藏條件為室溫避光或0_6°C冷藏。
[0028]本發明提供了蛹蟲草子囊孢子收集方法在蛹蟲草育種中的應用。
[0029]本發明利用細沙的摩擦作用，當干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果受到到細沙的摩擦作用從而破碎并釋放其中的子囊孢子，落入沙子載體中。通過收集肉眼可視的沙子，從而收集到肉眼不可見的蛹蟲草子囊孢子，因此本方法不僅能夠收集到彈出的子囊孢子，還能收集到未彈出的子囊孢子，子囊孢子的收集率達到100%，提高了子囊孢子的收集效率。而現有技術中采用彈射方法收集的子囊孢子只是子囊果成熟后彈射出的部分子囊孢子，子囊孢子數量不到子實體子囊果中所有子囊孢子總量的1%。本發明進一步將干燥的子實體取出，將子囊孢子活化或保存備用，最終實現了蛹蟲草子囊孢子的分離、收集和保藏的目的。本發明提供的蛹蟲草子囊孢子收集方法操作簡單，節省人力物力，同時提高了子囊孢子的收集率，提供的蛹蟲草子囊孢子保存方法能在2-4年內有效保持子囊孢子的生物活性，保持了原始親本的遺傳性狀，為選育新菌種提供有效方法，具有廣泛的應用前景。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0031]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0032]實施例1蛹蟲草子實體的培養
[0033]1、菌種:采用自主篩選獲得的菌株編號為HX-64蛹蟲草菌株(購自北京市農林科學院生物中心)。
[0034]2、液體搖瓶用培養基(IL):去皮土豆300g (煮汁)、葡萄糖10g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀 0.5g、硫酸鎂 lg、水 1000ml, ρΗ7.2。
[0035]3、子實體生產營養液:黃豆2%、葡萄糖1%、奶粉5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.05%、維生素BllOmg/lOOOml的比例配成營養液，調整pH在5.6~7.2。
[0036]4、采用PP料制成的培養盒(高10cm，上底直徑12cm，下底直徑8cm)。每盒大米40g和子實體生產營養液56g分裝混合，滅菌接種。
[0037]5、菌絲培養管理
[0038]培養室適宜溫度為18~25°C，濕度為70~85%，避光培養8天。菌絲布滿表面后開始通風培養。
[0039]6、子實體培養
[0040]在按種后待菌絲布滿整個培養容器并深扎到容器底，開始見光，但避免太陽光直射。若培養室光線太暗，可補充日光燈照。菌絲見光后，在培養料表面或四周見有桔黃色色素形成，并出現米粒狀的桔黃色菌蕾，菌蕾伸長后即成為子實體。子實體培育階段，溫度應為20~23°C，超過25°C生長緩慢，濕度應提高到80~85%。超過27°C菌絲萎縮不能出菌束。在子實體培養后期，逐漸加大室內空氣的流通和交換，培養室培養階段若發現污染應立即清除。[0041]7、采收:采后后平均鮮重達到28.7克/培養盒。
[0042]實施例2蛹蟲草子囊孢子的收集和保存(I)
[0043]( I)多孢載體吸附沙的準備:[0044]將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干。
[0045](2)多孢收集容器的滅菌及干燥處理:
[0046]取處理好的多孢載體吸附沙約25g與等量蒸餾水混合后放入250mL三角瓶中，然后整體121°C濕熱滅菌30min。滅菌后放入干燥箱中80°C干燥24小時直至完全干燥。
[0047](3)多孢分離親本子實體的選擇:
[0048]選取實施例1中的正在栽培瓶中生長后期的沒有受到污染的，子實體生長周期短、條形整齊，粗細均勻、顏色橘紅、子囊果發育成熟的栽培瓶經過瓶表面消毒后放入超凈工作臺。
[0049](4)多孢的收集:
[0050]選取子囊果發育成熟的子實體經過無菌操作將子囊果豐富的頭部用剪刀切取lcm，放入滅菌干燥過的多孢分離收集瓶中，每瓶收集5條。
[0051]室溫放置10天，直至子實體完全干燥。在這期間，一部分成熟的子囊果會自然彈射子囊孢子到細沙上，有部分成熟的子囊果尚未彈射子囊孢子就干燥了，還有一部分未完全成熟的子囊果沒有進入彈射時期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果內。
[0052]靜止干燥結束后，將多孢分離收集瓶放入搖床，以80r/min的轉速進行震蕩24小時。
[0053]由于細沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到細沙的摩擦作用從而破碎進而釋放其中的子囊孢子。然后將干燥的子實體部分取出，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。最終實現了蛹蟲草子囊孢子的分離、收集的目的。本實施例可收集到子實體上子囊果內的全部子囊孢子，收集率為100%。
[0054](5)多孢的保存
[0055]小試管用160°C 2小時干熱滅菌，將收集的含有彈射出成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子分裝于小試管中，然后用固體石蠟封口，防止水分進入，室溫避光保存2年。
[0056]實施例3蛹蟲草子囊孢子的收集和保存(2)
[0057](I)多孢載體吸附沙的準備:
[0058]將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用15%鹽酸浸泡，24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干。
[0059](2)多孢收集容器的滅菌及干燥處理:
[0060]取處理好的多孢載體吸附沙約50g與等量蒸餾水混合后放入250mL三角瓶中，然后整體121°C濕熱滅菌30min。滅菌后放入干燥箱中80°C干燥48小時直至完全干燥。
[0061](3)多孢分離親本子實體的選擇:
[0062]選取實施例1中正在栽培瓶中生長后期的沒有受到污染的，子實體生長周期短、條形整齊，粗細均勻、顏色橘紅、子囊果發育成熟的栽培瓶經過瓶表面消毒后放入超凈工作臺。
[0063] (4)多孢的收集:
[0064]選取子囊果發育成熟的子實體經過無菌操作將子囊果豐富的頭部用剪刀切取2cm，放入滅菌干燥過的多孢分離收集瓶中，每瓶大約收集10條。
[0065]室溫放置30天，直至子實體完全干燥。在這期間，一部分成熟的子囊果會自然彈射子囊孢子到細沙上，有部分成熟的子囊果尚未彈射子囊孢子就干燥了，還有一部分未完全成熟的子囊果沒有進入彈射時期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果內。
[0066]靜止干燥結束后，將多孢分離收集瓶放入搖床，以200r/min的轉速進行震蕩48小時。
[0067]由于細沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到細沙的摩擦作用從而破碎進而釋放其中的子囊孢子。然后將干燥的子實體部分取出，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。最終實現了蛹蟲草子囊孢子的分離、收集的目的。本實施例可收集到子實體上子囊果內的全部子囊孢子，收集率為100%。
[0068](5)多孢的保存
[0069]小試管用160°C 2小時干熱滅菌，將收集的含有彈射出成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子分裝于小試管中，然后用固體石蠟封口，防止水分進入，保藏條件為0°C冷藏4年。
[0070]實施例4蛹蟲草子囊孢子的收集(3)
[0071](I)多孢載體吸附沙的準備:
[0072]將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用20%鹽酸浸泡，24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干。
[0073](2)多孢收集容器的滅菌及干燥處理:
[0074]取處理好的多孢載體吸附沙約50g與等量蒸餾水混合后放入500mL三角瓶中，然后整體121°C濕熱滅菌30min。滅菌后放入干燥箱中80°C干燥38小時直至完全干燥。
[0075](3)多孢分離親本子實體的選擇:
[0076]選取實施例1中正在栽培瓶中生長后期的沒有受到污染的，子實體生長周期短、條形整齊，粗細均勻、顏色橘紅、子囊果發育成熟的栽培瓶經過瓶表面消毒后放入超凈工作臺。
[0077](4)多孢的收集:
[0078]選取子囊果發育成熟的子實體經過無菌操作將子囊果豐富的頭部用剪刀切取2cm，放入滅菌干燥過的多孢分離收集瓶中，每瓶大約收集8條。
[0079]室溫放置25天，直至子實體完全干燥。在這期間，一部分成熟的子囊果會自然彈射子囊孢子到細沙上，有部分成熟的子囊果尚未彈射子囊孢子就干燥了，還有一部分未完全成熟的子囊果沒有進入彈射時期，子囊孢子仍然保留在干燥的子囊果內。
[0080]靜止干燥結束后，將多孢分離收集瓶放入搖床，以150r/min的轉速進行震蕩40小時。
[0081 ] 由于細沙的摩擦作用，干燥的成熟的子囊果和未成熟的子囊果收到細沙的摩擦作用從而破碎進而釋放其中的子囊孢子。然后將干燥的子實體部分取出，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。最終實現了蛹蟲草子囊孢子的分離、收集的目的。本實施例可收集到子實體上子囊果內的全部子囊孢子，收集率達到100%。
[0082](5)多孢的保存
[0083]小試管用160°C 2小時干熱滅菌，將收集的含有彈射出成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子分裝于小試管中，然后用固體石蠟封口，防止水分進入，保藏條件為6°C冷藏3年。
[0084]實施例5收集保存的蛹蟲草子囊孢子的活化和培養
[0085]分別取實施例2-4收集和保存的蛹蟲草子囊孢子，在無菌條件下打開多孢保藏管，取部分沙粒于PDA斜面培養基上，長出菌落后再轉接一次。或取沙粒于適宜的液體培養基(IL液態培養基的配方為去皮土豆300g(煮汁)、葡萄糖10g、蛋白胨2g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂Ig^K 1000ml)中，增殖培養后直接做出菇實驗或再轉接斜面。
[0086]實施例2-4保存的蛹蟲草子囊孢子活化后，按照實施例1記載的方法進行蛹蟲草子實體的培養。培養結果發現，實施例2-4保存的蛹蟲草子囊孢子均能培養得到子實體，采后后平均鮮重分別達到28.7,28.9,28.8克/培養盒，子實體的產量和生物性狀與實施例1培養得到的子實體均無顯著差異，說明本發明收集和保存蛹蟲草子囊孢子的方法能夠保留親本遺傳性狀。本實施例結果說明:上述實施例2-4中的收集的蛹蟲草子囊孢子在室溫或普通冰箱條件下菌種保存2-4年仍具有生物活性，且子實體產量和生物轉化率無顯著差異，基本保留了原始親本的遺傳性狀。
[0087]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種蛹蟲草子囊孢子的收集方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將沙子放入能封口的多孢分離收集容器中，滅菌、干燥； 2)蛹蟲草子囊果發育成熟的子實體放入步驟I)中的多孢分離收集容器中； 3)振蕩多孢分離收集容器，收集含有彈射出的成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子。
2.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，所述步驟I)沙子為中性干燥沙子，其通過如下方法獲得: a)將河沙過60目篩，棄去大顆粒及雜質； b)再用80目過篩，棄去細沙，收集未過篩的沙子； c)去除沙子中的鐵質； d)用10%-20%的鹽酸浸泡沙子24h后，倒去鹽酸，用水洗泡至中性，烘干沙子。
3.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，步驟I)所述的沙子放入能封口的多孢分離收集容器中的放置方法 是將等質量的沙子與蒸餾水混合后，按體積比1:3-10置于多孢分離收集容器中。
4.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，步驟I)所述的滅菌是121°C，濕熱滅菌30mino
5.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，步驟I)所述的干燥是80°C干燥24-48h。
6.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，步驟2)所述的子實體放入多孢分離收集容器中，放入的子實體條數與容器中沙子的質量比為I條:2.5-5g。
7.如權利要求1所述的收集方法，其特征在于，步驟3)所述的振蕩是將多孢分離收集容器以80-200r/min轉速振蕩24-48h。
8.如權利要求1-7任一所述的收集方法，其特征在于，步驟3)中還包括將干燥的子實體取出。
9.一種蛹蟲草子囊孢子的保存方法，其特征在于，將權利要求1-6任一所述方法收集的含有彈射出成熟的子囊孢子和未彈射出的成熟的子囊孢子的沙子置于干燥無菌容器中密封保藏，保藏條件為室溫避光或0-6°C冷藏。
10.權利要求1-7任一所述的子囊孢子收集方法在蛹蟲草育種中的應用。
【文檔編號】A01G1/04GK103571788SQ201210282858
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月9日 優先權日:2012年8月9日
【發明者】胡健 申請人:北京中怡遠大機電設備有限公司