專利名稱：快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法
快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養技術領域，尤其涉及ー種快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法。
背景技木葡萄(Vitis vinifera L.)，葡萄屬(Vitis)落葉藤本植物，幾乎占全世界水果產量的四分之一，其營養價值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。近年來，“法國悖論”的科學發現引起人們對葡萄中生物活性物質的廣泛關注。研究表明，葡萄中富含白藜蘆醇、兒茶素、表兒茶素和鞣花酸等酚類和類酚類生物活性物質，具有 重要藥理功能和生物活性，具有良好的保健作用，尤其是白藜蘆醇具有抗癌的活性而受到市場的青睞。隨著市場需求的不斷擴大，原有的從葡萄或其他替代植物中來源的生物活性物質已不能滿足需要。植物細胞培養是生物技術領域里的ー個重要分支，因其具有生長速度快、周期短、不受季節影響、產物均一可控、藥效成分高于天然植物等優點，采用大規模植物細胞培養是解決藥用植物資源匱乏及藥效成分低的藥用植物滿足需求的重要途徑。近年來，植物細胞培養進行有效成分的生產已經取得了令人矚目的成就，而葡萄細胞培養生產次生代謝產物(如白藜蘆醇)的研究還處在實驗室的研究階段，進入中試和大規模培養還亟待解決如細胞株的篩選、細胞系的長期繼代保持、懸浮細胞系的建立和誘導子調控效率等諸多問題。為了解決這些問題，目前最關鍵的技術是建立快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法，但目前葡萄自然來源的外植體由于容易受到污染率和消毒劑的影響，存在愈傷組織誘導效率低，形成愈傷組織質量差，不能長期繼代保持等問題，導致葡萄細胞培養生產次生代謝產物的研究進行緩慢。直至目前，以葡萄葉片、葉柄、莖段等為外植體進行愈傷組織誘導取得了一定的進展，但以無菌株系小苗莖段和葉片誘導愈傷組織，并進行繼代增殖以獲得松散型愈傷組織、及對該松散型愈傷組織長期繼代保持的方法還鮮有報道。
發明內容本發明所要解決的技術問題在于提供ー種快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，并揭露了將所獲得的葡萄松散型愈傷組織進行保持的方法。本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的ー種快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，其包括如下步驟(I)葡萄無菌株系的獲得選取經預處理后的當年生無病葡萄枝條的帶節莖段，之后將所選取的帶節莖段接種到附加0. lmg/L NAA的1/2MS培養基上誘導產生葡萄無菌株系；其中預處理包含清洗、風干表面水分，并殺菌消毒；(2)啟動培養取步驟(I)所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0. 5cm莖段或切取0. 5cmX0. 5cm見方大小的葉片作為外植體，接著將該外植體接種至誘導愈傷組織的培養基中，并將該培養基置于培養室中培養，7天后可見愈傷組織形成，25 30天后長成初代愈傷組織；(3)制備葡萄松散型愈傷組織將步驟(2)培養得到的初代愈傷組織轉接到繼代増殖培養基中，并將該繼代增殖培養基置于培養室中進行繼代増殖培養，以獲得葡萄松散型愈傷組織；其中，步驟(2)與步驟(3)中所述培養室中的條件均為溫度設置23 25°C，光照強度 150(T20001x，每天光照 12h。進ー步地，步驟(2)中所述誘導愈傷組織的培養基為MS+BA 2. Omg/L+NAA
0.2mg/L+ 鹿糖 30g/L+ 瓊脂粉 6g/L。 進ー步地，步驟(3)中所述繼代增殖培養基為MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。進ー步地，揭露了上述所獲得的葡萄松散型愈傷組織長期繼代保持的方法，其操作如下取上述步驟(3)所獲得的葡萄松散型愈傷組織，并接于第一種培養基中繼代保持至少2代后，轉接到第二種培養基中繼代保持I代，如此反復交替繼代培養，即可長期繼代保持葡萄松散型愈傷組織，且繼代保持時的該第一種培養基、第二種培養基均置于培養室中進行；其中，所述第一種培養基為MS+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L ;所述第ニ種培養基為MS+2，4-D I. Omg/L+KT 0. 5mg/L+AgN03 5. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂粉 6g/L ；所述培養室中的條件為溫度設置23 25°C，光照強度150(T20001x，每天光照12h。本發明快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法的有益效果在干通過本發明所揭露的方法不僅能夠快速獲得大量松散型葡萄愈傷組織，且過程中所獲得的葡萄愈傷組織具有高誘導效率及高質量的優點，同時可長期繼代保持獲得的葡萄松散型愈傷組織，即具有旺盛的生長能力，從而為葡萄細胞培養生產次生代謝產物和生物技術等研究奠定了良好的基礎。
具體實施方式一、葡萄松散型愈傷組織的制備I.實驗材料的選取與預處理從福建省戴云山脈采集當年生無病的野生葡萄枝條，并將其帶回實驗室用自來水加洗滌劑(一般用洗衣粉)浸泡30min，然后流水沖洗l_2h，取出后風干枝條表面水分，之后枝條置于無菌條件下并加入適量的75%こ醇(v/v)浸泡30s，倒去こ醇后加入適量的0. 1%HgCl2 (w/v)消毒8min,接著用無菌水浸洗5次,最后切取0. 5cm帶節莖段備用。2.葡萄無菌株系的建立取備用的0. 5cm帶節莖段并將其接種到附加0. lmg/L NAA的1/2MS培養基上誘導產生葡萄無菌株系。3.啟動培養取步驟2所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0.5cm莖段或
0.5cmX0. 5cm見方大小的葉片作為外植體，接著將該外植體接種至誘導愈傷組織的培養基中，并將該培養基置于培養室中培養，7天后可見愈傷組織形成，25 30天后長成初代愈傷組織；4.制備葡萄松散型愈傷組織將步驟3培養得到的初代愈傷組織轉接到繼代増殖培養基中，并將該繼代增殖培養基置于培養室中進行繼代増殖培養，以獲得葡萄松散型愈傷組織。ニ、葡萄愈傷組織誘導中各影響因素的篩選I.不同外植體類型對愈傷組織誘導的影響取制備葡萄松散型愈傷組織過程中所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0. 5cm莖段與0. 5cmX0. 5cm見方大小的葉片并分別接種到下表I中的Gl培養基(即MS+BA2. Omg/L+NAAO. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L)中，且在光照下培養，接種7d后，莖段、及葉片切ロ處均可觀察到愈傷組織形成，以后愈傷組織塊會不斷膨大，25 30d后長成初代愈傷組織。從產生愈傷組織的能力上看，莖段或葉片的差別不大，但 從愈傷組織的長勢上，初代培養時，莖段產生的愈傷組織長勢較強；而葉片產生的愈傷組織，長勢比較弱，要及時繼代，否則會變褐死亡。因此，取0. 5cm莖段作為啟動培養的外植體為佳。2.不同培養條件對愈傷組織誘導的影響將野生葡萄莖段接種在下表I中的Gl培養基中，比較光照和黑暗對野生葡萄莖段愈傷組織誘導的影響。結果發現，在光照條件下愈傷組織誘導率為100%，產生4種類型的愈傷組織，GCl類型是淡黃色、淺黃緑色或無色的松散狀愈傷組織，GC2是綠色或淡黃緑色硬塊狀的愈傷組織，GC3類型是GCl和GC2的混合類型，GC4型愈傷組織呈無色粉狀或水潰狀；在黑暗中培養誘導產生的愈傷組織，為無色或淺褐色水潰狀或粉狀，這種愈傷組織繼代后會褐變死亡，也定為GC4型愈傷組織。以上試驗分析表明，野生葡萄愈傷組織的誘導適合在光照的條件下進行，雖然產生了 4種類型愈傷組織，但在后期的篩選中，可以得到松散的、生長狀態良好的愈傷組織；而黑暗條件不利于野生葡萄愈傷組織的誘導。由于GC1、GC2、GC3類型的愈傷組織可以繼代増殖，為有效愈傷組織；而GC4類型愈傷組織不能繼代保持，為無效愈傷組織。因此，為了獲得松散型愈傷組織，需在光照條件下進行愈傷組織誘導。3.啟動培養中附加成份的不同對愈傷組織誘導的影響取制備葡萄松散型愈傷組織過程中所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0. 5cm莖段井分別接種到已滅菌且編號分別為G1、G2、G3、G4、G5及G6的6個培養基中，這6個培養基中均包含基本培養基及附加成份，該基本培養基為MS+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L、且pH值為5. 8 6. 0,各培養基中的附加成份及其含量如表I所不；之后將各培養基置于培養室中誘導愈傷組織，30天后比較不同附加成份對愈傷組織誘導的影響，結果見表2。表I各培養基中的附加成份及其含量
權利要求
1.一種快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，其特征在于該方法包括如下步驟 (1)葡萄無菌株系的獲得選取經預處理后的當年生無病葡萄枝條的帶節莖段，之后將所選取的帶節莖段接種到附加0. lmg/L NAA的1/2MS培養基上誘導產生葡萄無菌株系；其中預處理包含清洗、風干表面水分，并殺菌消毒； (2)啟動培養取步驟(I)所獲得的葡萄無菌株系的小苗，切取0.5cm莖段或切取0.5cmX0. 5cm見方大小的葉片作為外植體，接著將該外植體接種至誘導愈傷組織的培養基中，并將該培養置基于培養室中培養，7天后可見愈傷組織形成，25 30天后長成初代愈傷組織； (3)制備葡萄松散型愈傷組織將步驟(2)培養得到的初代愈傷組織轉接到繼代增殖培養基中，并將該繼代增殖培養基置于培養室中進行繼代增殖培養，以獲得葡萄松散型愈傷組織； 其中，步驟(2)與步驟(3)中所述培養室中的條件均為溫度設置23 25°C，光照強度1500 20001x，每天光照12h。
2.根據權利要求I所述的快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，其特征在于步驟(2)中所述誘導愈傷組織的培養基為MS+BA 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。
3.根據權利要求I所述的快速獲得葡萄松散型愈傷組織的方法，其特征在于步驟(3)中所述繼代增殖培養基為MS+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L。
4.一種葡萄松散型愈傷組織長期繼代保持的方法，其特征在于其操作如下取權利要求I所獲得的葡萄松散型愈傷組織，并接于第一種培養基中繼代保持至少2代后，轉接到第二種培養基中繼代保持I代，如此反復交替繼代培養，即可長期繼代保持葡萄松散型愈傷組織，且繼代保持時的該第一種培養基、第二種培養基均置于培養室中進行；其中，所述第一種培養基為MS+2，4-D I. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉6g/L ;所述第二種培養基為MS+2, 4-D I. Omg/L+KT 0. 5mg/L+AgN03 5. Omg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂粉 6g/L ;所述培養室中的條件為溫度設置23 25°C，光照強度150(T20001x，每天光照12h。
全文摘要
本發明提供快速獲得葡萄松散型愈傷組織及其長期繼代保持的方法，依次通過制備葡萄無菌株系、啟動培養、制備葡萄松散型愈傷組織來獲得葡萄松散型愈傷組織，并將獲得的葡萄松散型愈傷組織接于第一種培養基中繼代保持至少2代后，轉接到第二種培養基中繼代保持1代，反復交替即可長期繼代保持葡萄松散型愈傷組織，且繼代保持時的該第一種培養基、第二種培養基均置于培養室中進行。本發明的優點在于所獲得的葡萄愈傷組織具有高誘導效率及高質量的特點，同時可長期繼代保持獲得的葡萄松散型愈傷組織，從而為葡萄細胞培養生產次生代謝產物和生物技術等研究奠定了良好的基礎。
文檔編號A01H4/00GK102763593SQ20121024611
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者余亞白, 范麗華, 謝鴻根, 賴呈純 申請人:福建省農業科學院農業工程技術研究所