專利名稱：加速黃柄鵝膏菌絲體生長的優化培養方法
技術領域：
本發明涉及一種加速黃柄鵝膏/Varices)菌絲體生長的培養方法,屬于生物技術領域，具體地說是屬于大型真菌室內培養范疇。
背景技術：
鵝膏菌屬―)隸屬于擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鵝膏菌科 teceae)，是有毒的大型真菌中較特殊、較有價值的一個世界性廣布大屬,其物種多 樣性是非常豐富的，全球已報道近400種，中國已記錄的近100種(含亞種、變種及變型)。鵝膏菌屬中的大部份種屬于著名劇毒菌，因此，鵝膏的價值在于其毒素。鵝膏菌毒素可分為四類，其中最主要也是最重要的是肽類毒素，肽類毒素又包括鵝膏毒肽(amatoxins)、鬼筆毒肽(phallotoxins)和毒傘素類(virotoxins)三種。鵝膏毒素的應用研究主要體現在以下幾方面①可用于研究真核生物基因的表達、調控及細胞定位；②可開發抗菌、抗病毒、抗腫瘤、鎮靜麻醉及其它特效新藥；③可用于生物防冶。鵝膏菌屬大多屬于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培，難以開發利用。雖然已有少數的種能進行菌絲的純培養，但也存在一些問題，如菌絲生長緩慢、菌絲中毒素含量不高。鵝膏多肽毒素是一種由7-8個被修飾了的稀有氨基酸組成的環肽，可能不是基因編碼的直接產物，而是經過加工后的次級產物，要克隆毒素的基因是復雜而困難的，且其化學合成品也沒有活性。因此，至今國內外還沒有一種能規模化開發的毒素產品。現作為生化試劑的肽類毒素全部來源于歐美的毒鵝膏(Mrnnita phalloides)子實體，銷價昂貴。鵝膏種群小，個體少，產量低，分布數量極其有限。加之對生境敏感，一旦生境受到破壞，極易消失或滅絕，屬于特殊的致危生物類群，這更增加了其進一步被研究、利用的難度。鵝膏的人工馴化或栽培是保證鵝膏資源可持續性利用的前提或關鍵，但此目前仍然屬于難以攻克的問題及盲點，其中菌絲難以誘導，菌絲生長非常緩慢是制約及影響人工培養的重要環節或因素。黃柄鵝膏菌flavipes Imai)是鵝膏屬中的一個廣布種,主要分布于云南、四川、西藏(東南部林區)，其形態特征如下子實體較小或中等；菌蓋直徑3-7. 5cm,初期卵圓形，后扁平至近平展，褐色到黃褐色，中央色深而向邊緣色淺呈黃色，表面濕時粘附有暗黃或金黃色塊狀粉質鱗片；菌肉白色，近表皮下褐黃色；菌褶白色帶黃色，離生，不等長，較密；菌柄較長，柱形，向下漸粗，長7-lOcm，粗0. 6-lcm,淡黃且上部白色帶黃色，基部呈球形且有環帶狀金黃色斑紋或粉末狀菌托殘痕，內部松軟至空心；菌環膜質，黃色，生柄之中上部，上表面有細條紋；孢子形狀從寬橢圓形至近卵圓形，光滑，無色，7. 5-10 u mX 5-7. 5 u m,糊性反應。本發明以云南武定獅子山自然保護區采集的黃柄鵝膏菌為材料，成功分離到了該種的菌絲，但菌絲生長非常慢，難以擴繁，本發明征對此問題進行了重點突破。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種簡單，生產成本低，能促進菌絲快速生長的固體培養方法。本發明的技術方案，其步驟為
(I)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
(2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
(3)菌絲體誘導將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 30 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 0. 32 g/L、Vbi
0.10mg/L、麥芽汁150 1111/1、瓊脂11.0(^/1，控制？11值為5.4左右)表面，培養溫度為21 220C，暗培養14 18天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
(4)菌絲體均一性與擴大培養將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過38 40天的暗培養，培養皿中形成直徑2. 5 3. Ocm的圓形規則菌落，用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養,每35 36天擴大培養一次；
(5)培養基改良及優化以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(過80 100目分樣篩)60. 00 80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I. 50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，22 25天，菌絲直徑為7. 5 8. 5cm,菌絲基本長滿培養皿。本發明的有益效果是采用簡單培養基，使菌絲能快速增殖，縮短了生長周期，其特點如下，
(1)操作簡單在誘導培養基基礎上，對培養基進行了優化，使菌絲在短時間內大量繁
殖；
(2)周期縮短、生長速度加快本發明使培養時間從40天左右縮短到25天左右，而且菌絲生長速度明顯提高，約為原來的3倍；
(3)生產成本低；本發明的培養基主要利用腐葉干粉、生境土等天然材料，成本低、效果好。
具體實施例方式以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實例一
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 30g/L、谷氨酸 0. 32 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為21 22°C，暗培養14天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過40天的暗培養,培養皿中形成直徑3. Ocm的圓形規則菌落,用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養，每35天擴大培養一次；
以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯100. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過80目分樣篩)30. 00g/L、生境土干 粉(過 80 目分樣篩)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00g /UNH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁200ml/L、瓊脂6. 00 g/L,控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，25天，菌絲直徑為8. 5cm,菌絲基本長滿培養皿。實例二
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為21 22°C，暗培養16天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，55天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過39天的暗培養,培養皿中形成直徑2. 8cm的圓形規則菌落,用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養，每36天擴大培養一次；
以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯120. 00g/L、葡萄糖12. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過100目分樣篩)40. 00g/L、生境土干粉(過 100 目分樣篩)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00g/L、NH4NO3O. 60g/L、6_BAl. 30mg/L、麥芽汁 230ml/L、瓊脂7. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，23天，菌絲直徑為8. Ocm,菌絲基本長滿培養皿。實例三
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. OOg/L, NH4NO3 0. 35g/L、谷氨酸 0. 30 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為21 22°C，暗培養18天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過40天的暗培養,培養皿中形成直徑2. 5cm的圓形規則菌落,用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養，每35天擴大培養一次；
以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯110. 00g/L、葡萄糖9. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過80目分樣篩)50. 00g/L、生境土干粉(過80 目分樣篩)60. 00g/L、蛋白胨 4. 00 g /UNH4NO3 0. 70g/L、6_BAl. 20mg/L、麥芽汁 210ml/L、瓊脂8. 00 g/L,控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，22天，菌絲直徑為7. 5cm,菌絲基本長滿培養皿。實例四 野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 38g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為21 22°C，暗培養15天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，58天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；
將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過38天的暗培養,培養皿中形成直徑2. 8cm的圓形規則菌落,用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養，每35天擴大培養一次；以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯105. 00g/L、葡萄糖11. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過100目分樣篩)35. 00g/L、生境土干粉(過 100 目分樣篩)75. 00g/L、蛋白胨 3. 50g/L、NH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麥芽汁 220ml/L、瓊脂6. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，24天，菌絲直徑為8. 2cm,菌絲基本長滿培養皿。實例五
野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體；
將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊；
將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基(馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 32g/L、谷氨酸 0. 31 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麥芽汁 150 ml/L、瓊脂 11. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)表面，培養溫度為21 22°C，暗培養17天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，56天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲；將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過39天的暗培養,培養皿中形成直徑2. 9cm的圓形規則菌落,用直徑I. O cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養，每36天擴大培養一次； 以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基(馬鈴薯115. OOg/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐葉干粉(過80目分樣篩)45. 00g/L、生境土干粉(過 80 目分樣篩)80. 00g/L、蛋白胨 4. 50g /UNH4NO3 0. 65g/L、6_BAl. 30mg/L、麥芽汁 200ml/L、瓊脂6. 00g/L,控制PH值為5. 4左右)，使用該培養基，23天，菌絲直徑為7. 8cm,菌絲基本長滿培養皿。
權利要求
1.一種加速黃柄鵝膏/Varices)菌絲體生長的培養方法,其特征為,采用成熟子實體室內誘導菌絲，征對菌絲體培養過程中菌絲體生長極其緩慢等問題，通過培養基改良，提供能促進菌絲快速生長的優化培養基，主要包括下列步驟 (1)材料的選擇野外采摘生長優良、無蟲害、未開傘或未完全開傘、菌柄較粗壯、菌蓋較肥厚的成熟子實體； (2)材料的消毒及處理將子實體帶回實驗室，于超凈臺上用酒精棉球，輕擦菌蓋表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，將子實體從菌蓋中部一分為四，用解剖刀取菌柄與菌蓋交接處的內部組織塊，切成約0. 08 0. 16cm2的小塊； (3)菌絲體誘導將以上切分的小組織塊輕輕嵌入試管斜面誘導培養基表面，培養溫度為21 22°C，暗培養14 18天，菌塊周圍開始萌發出極少白色菌絲，53 60天，組織塊多處隆起，表面長出團狀、稠密的絨毛狀白色菌絲； (4)菌絲體均一性與擴大培養將上面誘導出的菌絲體從試管中轉接入培養皿(誘導培養基)，在溫度為21 22°C下，經過38 40天的暗培養，培養皿中形成直徑2. 5 3. Ocm的圓形規則菌落，用直徑I. 0 cm的圓形打孔器取菌落邊緣同一生長期的菌塊進行擴大培養,每35 36天擴大培養一次； (5)培養基改良及優化以誘導培養基為基礎，對菌絲體的培養基進行了反復篩選，得到了優化的培養基，使用該培養基，22 25天，菌絲直徑為7. 5 8. 5cm，菌絲基本長滿培養皿。
2.根據權利要求I所述的加速黃柄鵝膏菌絲體生長的培養方法，其特征在于步驟(3)中的誘導培養基為馬鈴薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4NO3 0. 30 0. 40g/L、谷氨酸、0.28 0.32 g/L、VB1 0. 10mg/L、麥芽汁 150 1111/1、瓊脂11.00 g/L，控制 PH值為 5. 4 左右。
3.根據權利要求I所述的加速黃柄鵝膏菌絲體生長的培養方法，其特征在于步驟(5)中的優化培養基為馬鈴薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青網腐葉干粉(過80 100目分樣篩)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(過80 100目分樣篩)60. 00 、80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I. 50mg/L、麥芽汁200 230 ml/L、瓊脂6. 00 8. 00 g/L,控制PH值為5. 4左右。
全文摘要
本發明涉及一種加速黃柄鵝膏(Amanitaflavipes)菌絲體生長的培養方法，屬于大型真菌培養技術領域。其特征為由未開傘的成熟子實體誘導菌絲體，通過培養基改良，提供簡單、培養周期短、成本低，能促進菌絲快速生長的優化培養基。鵝膏屬是特殊珍貴的大型經濟真菌，其價值大應用范圍廣，在開發新特效藥如抗腫瘤、抗菌抗病毒、鎮靜或麻醉藥等領域具有潛在地應用前景，但至今因其資源珍稀、難以人工馴化、毒素的化學合成品無活性等問題尚難以開發應用。本發明以云南武定獅山采集的黃柄鵝膏為材料，征對其菌絲難以誘導、菌絲生長非常緩慢等制約培養的問題進行了創新性突破，為今后鵝膏菌絲規模化培養及人工馴化等提供了條件。
文檔編號A01G1/04GK102696404SQ20121023701
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者何雋, 馮遼遼, 吳鵬, 周文, 唐萍, 張曦予, 李宗菊, 李彪, 趙昱 申請人:云南大學