專利名稱：一種白術的保存方法以及再培養方法
技術領域：
本發明涉及ー種白術的保存方法以及再培養方法。
背景技術：
白術(Atrac tylodes macrocephala Koidz.)為菊科蒼術屬植物,其根莖入藥，為重要的藥用植物。由于市場需求高，人類的長期采挖以及環境破壞，導致白木野生資源較少，目前主要通過人工栽培以保證資源滿足市場的需求。我國大部分 地方均有引種栽培，習以浙江于潛、安徽皖南山區等為道地。目前，常利用白術種子或塊根莖在保存圃或繁種圃內通過田間種植方式進行保存和繁殖。利用種子繁殖，易發生變異，可能會出現品種退化、種質混雜的現象；利用塊根繁殖，難以短期大量獲得種質資源。而且以田間種植方式進行的保存不僅占用耕地，還需耗費大量人力物カ進行栽培管理，干旱、洪澇、低溫、熱害、病蟲害等自然災害還可能導致種質資源丟失，因此采用田間方式不宣進行長期保存。為保存種質資源，國內已開展白木的離體組織培養、快繁研究，獲得了適宜發芽、擴繁、生根等培養的組織培養基和培養條件，可在短期內獲得大量組培苗。但組織繼代培養，多次繼代也可能會導致遺傳變異，同時定期繼代需耗費人力、物力。因此，目前仍需尋找最適的長期保存方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種白術的保存方法以及再培養方法。本發明提供了一種白術的保存方法，依次包括如下步驟(I)取白術組培苗的莖尖，在預培養液中進行預培養；所述預培養液為含0. 3mol/L蔗糖的MS液體培養基；(2)取完成步驟(I)的莖尖，在預處理液中進行預處理；所述預處理液為含2. OmoI/L甘油和0. 4mol/L蔗糖的MS液體培養基；(3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護劑中進行處理；所述玻璃化保護劑的制備方法為將3. 26mol甘油、2. 42molこニ醇、I. 9mol ニ甲基亞砜和0. 4mol蔗糖與MS液體培養基混勻至IL ；(4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。步驟(I)中，所述莖尖可為I. 5-2mm的莖尖。所述白術組培苗具體可為2個月苗齡的白術組培苗。步驟(I)中，所述預培養的條件可為25°C暗培養1-4天(具體可為3天)。步驟(2)中，所述預處理可為將完成步驟(I)的莖尖在所述預處理液中室溫浸泡30分鐘(優選振蕩處理)。所述室溫具體可為20-30°C (如25°C)。步驟(3)中，所述處理可為將完成步驟(2)的莖尖在所述玻璃化保護劑中0°C浸泡60分鐘。所述步驟(4)包括如下步驟完成所述步驟(3)后，將含有莖尖的玻璃化保護劑滴加至鋁箔上，然后將鋁箔轉移至充滿液氮的凍存管中，然后將所述凍存管投入液氮中保存。每滴含有所述莖尖的玻璃化保護劑具體可為16微升。每滴含有所述莖尖的玻璃化保護劑具體可含有5個所述莖尖。本發明還保護ー種將以上任一所述方法保存后的白術進行再培養的方法，包括如下步驟將以上任一所述方法保存后的白術進行再培養，得到白術植株。所述再培養包括如下步驟將解凍后的白木莖尖先在含0. 3mol/L蔗糖的MS半固體培養基中暗培養I天，然后在含0. 3mg/L6-BA、0. 02mg/L NAA和0. lmg/L GA3的MS固體培養基中暗培養5-7天(莖尖返綠并有萌動跡象)，再然后轉移至MS固體培養基中正常光照培養。所述再培養方法還包括在進行再培養之前將以上任一所述方法保存后的白木用含I. 2mol/L蔗糖的MS液體培養基洗滌的步驟。所述預培養的作用可以降低莖尖組織細胞自由含水量，増加可溶性糖等保護性物質含量，從而提高莖尖的抗凍能力、減少或避免冷凍傷害，提高植株存活率。所述預處理的作用進ー步降低莖尖組織細胞含水量，以避免轉入較高濃度的玻璃化保護劑中快速脫水。所述玻璃化劑的作用加入玻璃化劑，使莖尖組織細胞在降溫過程中達到玻璃化狀態，避免細胞內形成冰晶損傷細胞膜。本發明提供了一種白術的超低溫保存方法以及在超低溫保存的基因上進行再培養，最終獲得白術植株的方法。采用本發明提供的方法進行保存和再培養，植株再生率可達60%以上。本發明提供的方法成本低廉、操作簡便、植株再生率，避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險，是白術種質資源離體保存的一條有效途徑。
圖I為組培苗的照片。圖2為莖尖的照片。圖3為滴加含有莖尖的PVS2玻璃化保護劑后的鋁箔條。圖4為轉入MS固體培養基中正常光照培養7天后的照片。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑公司購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。6-BA即6-(芐氨基)嘌呤，結構式見式(I )。
權利要求
1.一種白術的保存方法，依次包括如下步驟 (1)取白術組培苗的莖尖，在預培養液中進行預培養；所述預培養液為含0.3mol/L蔗糖的MS液體培養基； (2)取完成步驟(I)的莖尖，在預處理液中進行預處理；所述預處理液為含2.Omol/L甘油和0. 4mol/L蔗糖的MS液體培養基； (3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護劑中進行處理；所述玻璃化保護劑的制備方法為將3. 26mol甘油、2. 42mol乙二醇、I. 9mol 二甲基亞砜和0. 4mol蔗糖與MS液體培養基混勻至IL ； (4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述莖尖為I.5-2mm的莖尖。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于步驟(I)中，所述預培養的條件為25°C暗培養1-4天。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于步驟(2)中，所述預處理為將所述完成步驟(I)的莖尖在所述預處理液中室溫浸泡30分鐘。
5.如權利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述處理為將所述完成步驟(2)的莖尖在所述玻璃化保護劑中0°C浸泡60分鐘。
6.如權利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(4)包括如下步驟完成所述步驟(3)后，將含有莖尖的玻璃化保護劑滴加至鋁箔上，然后將鋁箔轉移至充滿液氮的凍存管中，然后將所述凍存管投入液氮中保存。
7.將權利要求I至6中任一所述方法保存后的白術進行再培養的方法，包括如下步驟將權利要求I至6中任一所述方法保存后的白術進行再培養，得到白術植株。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述再培養包括如下步驟將解凍后的白術莖尖先在含0. 3mol/L蔗糖的MS半固體培養基中暗培養I天，然后在含0. 3mg/L6_BA、0. 02mg/L NAA和0. lmg/L GA3的MS固體培養基中暗培養5_7天，再然后轉移至至MS固體培養基中光照培養。
9.如權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述方法還包括在進行再培養之前將權利要求I至5中任一所述方法保存后的白術用含I. 2mol/L蔗糖的MS液體培養基洗滌的步驟。
全文摘要
本發明公開了一種白術的保存方法以及再培養方法。本發明提供的保存方法包括如下步驟(1)取白術組培苗的莖尖，在預培養液中進行預培養；所述預培養液為含0.3mol/L蔗糖的MS液體培養基；(2)取完成步驟(1)的莖尖，在預處理液中進行預處理；所述預處理液為含2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖的MS液體培養基；(3)取完成步驟(2)的莖尖，在玻璃化保護劑中進行處理；所述玻璃化保護劑的制備方法為3.26mol甘油、2.42mol乙二醇、1.9mol二甲基亞砜和0.4mol蔗糖與MS液體培養基混勻至1L；(4)將完成步驟(3)的莖尖投入液氮中保存。本發明提供的方法成本低廉、操作簡便、植株再生率，是白術種質資源離體保存的一條有效途徑。
文檔編號A01H4/00GK102763591SQ20121023268
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者盧新雄, 張金梅, 辛霞, 陳曉玲 申請人:中國農業科學院作物科學研究所