專利名稱：體外培養誘導淋巴細胞制備mhcⅱ類分子的方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種MHC II類分子的生產方法，尤其是一種操作簡單、成本低、產量高、原料用量少、避免產品攜帶外源病毒及其他病源微生物的體外培養誘導淋巴細胞制備MHCII類分子的方法及應用。
背景技術：
主要組織相容性復合體(majorhistocompatibility complex, MHC)是一個與機體免疫反應相關的基因群，該基因群有100多個基因位點，其編碼產物包括MHCI類分子和MHC II類分子，是一些能夠提呈抗原的分子，在調節免疫應答和免疫細胞發育中發揮作用。MHC II類分子是呈現在免疫系統特定細胞(APC)表面的由a鏈和0鏈非共價鏈相連組成的一組高度多態性的跨膜糖蛋白，可提呈經過加工的外來抗原給輔助性T細胞的抗 原受體，導致輔助性T細胞激活和分化，從而在誘發免疫應答中起重要的作用。如在一些病毒感染的疾病中，病毒的某些蛋白就是通過干擾MHC II的功能，影響了正常的免疫識別。MHC II類分子在抗原提呈過程中可介導APC的多條信號轉導通路、凋亡等多種生物學行為，一些在正常情況下不表達MHC II類分子的細胞，在生長過程中亦可受細胞因子等誘導表達MHC II類分子，因此MHC II類分子的表達被看成是抗原遞呈能力的標志。細胞因子(cytokine, CK)則是一類能在細胞間傳遞信息的蛋白質或小分子多肽，通過與靶細胞膜表面的受體相結合并將信號傳遞到細胞內部以發揮廣泛多樣的生物學功能。免疫活性細胞產生的具有免疫調節和效應功能的細胞因子，以其多種多樣的生物學活性，在體內構成功能性細胞因子網絡，彼此協作或相互制約，對細胞間相互作用、細胞的增殖分化和效應功能有重要的調節作用，有助于提高MHC II類分子的免疫增效作用。由于現有MHCII類分子的提取方法存在著操作復雜、原料來源較少、得率低、成本高以及潛在攜帶外源病毒及其他病原微生物的危險，很難實現產業化，迄今為止，未發現國內外關于MHCII類分子相關產品的報道。
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡單、成本低、產量高、原料用量少、避免產品攜帶外源病毒及其他病源微生物的體外培養誘導淋巴細胞制備MHCII類分子的方法及應用。本發明技術解決方案是一種體外培養誘導淋巴細胞制備MHC II類分子的方法，其特征在于包括如下步驟
a.用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層；
b.對淋巴細胞單層進行傳代培養；
c.當傳代淋巴細胞長成單層后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人參皂苷、美洲商陸及腫瘤刺激劑中的至少兩種絲裂原誘導培養48小時，絲裂原加入量為5 10ug/mL ；
d.將細胞培養物經超聲破碎后取樣檢測MHCII類分子的濃度。
—種上述體外培養誘導淋巴細胞制備MHC II類分子的方法制備的MHC II類分子，其特征是在提高動物免疫力飼料添加劑中的應用。本發明以較少的脾臟或外周血為原料，制備淋巴細胞單層，在體外培養、誘導淋巴細胞單層即可生產出大量的MHCII類分子，具有以下優點 I.無需進一步提純，可以經過凍融、超聲破碎、過濾處理后直接將產品飼料添加劑的形式以口服途徑或作為疫苗稀釋劑給動物使用，反應時間縮短，作用期限延長，使用量少，無種屬特異性，即可起到免疫增效的作用效果，進而提升受體的免疫功能。2.生產工藝簡單，原料用量少，無需宰殺大量的動物，即可生產出大量的產品，產量高且成本低，可以節省大量的人力、物力。3.可以避免產品中攜帶外源病毒及其他病原微生物。4.可多次傳代培養生產MHCII類分子。
圖I是本發明實施例I新城疫抗體效價監測結果示意圖。圖2是本發明實施例2新城疫抗體效價監測結果示意圖。圖3是本發明實施例3新城疫抗體效價監測結果示意圖。
具體實施例方式實施例I :
具體操作方法可以按以下步驟進行
a.處理新鮮豬脾臟；
取新鮮豬脾臟，立即放入無菌燒杯中，加入平衡鹽液浸泡半小時或浸于1%新潔爾滅溶液中，取出以碘酒酒精消毒脾臟表面，用解剖剪及鑷子去除脾臟脂肪及包膜，用平衡鹽液洗滌一次，再將脾臟剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪將脾臟剪成Imm3小塊，再用平衡鹽液洗滌2-3次，以去除血細胞、色素物質及剪碎過程中機械損傷的細胞；
b.消化及分散組織塊；
將上步清洗過的平衡鹽液吸掉，將剪碎的組織塊移入三角燒瓶中，按組織塊體積的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(PH7. 6-7. 8)，置37°C水浴中消化30分鐘，每隔10分鐘搖動一次錐形瓶，以便組織塊散開，以利繼續消化，直到組織變成松散、表面發毛時為止，這時從水浴中取出錐形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用平衡鹽液洗滌3次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口徑稍大的吸管吹打數次，用四層紗布過濾；
c.細胞計數；
采用標有0. Imm字樣的血球計數板進行計數，計數方法與白細胞計數方法相同；
d.細胞懸液的分裝和培養；
按細胞計數結果，將細胞懸液用DMEM營養液調整至60萬/毫升細胞懸液，將細胞懸液分裝入細胞培養瓶和細胞轉瓶，分裝量為該瓶容量的1/5，蓋上蓋，做好標識，然后將細胞培養瓶和轉瓶分別放在二氧化碳培養箱和轉瓶機上培養；
e.觀察；
置于37°C培養的細胞，需逐日進行觀察，若細胞已生長，則要觀察細胞的形態特征并判斷其所處的生長階段(游離期、吸附期、繁殖期、維持期和衰退期)，直至形成淋巴細胞單層；
f.對淋巴細胞單層進行傳代培養；
g.當傳代淋巴細胞長成單層后，進行誘導培養；
當顯微鏡下觀察傳代淋巴細胞長成單層后，加入溶解過濾后的刀豆蛋白A (Con A)、美洲商陸(PWM)和人參皂苷(GS)誘導培養，加入量分別是刀豆蛋白A (Con A)5ug/mL、美洲商陸(PWM) 2ug/mL 和人參皂苷(GS) lug/mL ； h.誘導培養48小時后對產品進行檢驗；
將細胞培養物經凍融、超聲波破碎、過濾后取樣檢測。本實施例I所得培養物中MHCII類分子的含量為1000 2500ng/L ；
MHCII類分子的含量測定對MHCII類分子的定量多以多肽含量定量，利用紫外分光光度計或ELISA檢測試劑盒進行測定多肽含量(以多肽含量Img為一個單位)；i 半成品和成品的檢驗。半成品檢驗半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、pH值等項檢測，檢測要求應符合中華人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。成品檢驗成品進行MHCII類分子的含量檢測、外觀檢測、pH值、多肽含量、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒素等項檢測，檢測要求應符合中華人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。實驗例I :
臨床實驗具體操作方法按以下步驟進行 a.新城疫(Clone30株)疫苗配制
取新城疫(Clone30株)疫苗，購自哈爾濱獸醫研究所，按說明書的劑量配制，其中用量為50微升/羽。b.實驗分組免疫
將實驗雞群分為兩組，對照組和實驗組，均待雞群母源抗體為零時進行免疫。對照組正常免疫新城疫(Iasota株)疫苗，滴鼻或滴口 50微升/羽；實驗組正常免疫新城疫(Iasota株)疫苗，滴鼻或滴口 50微升/羽，同時口服本發明實施例I的培養物(做為飼料添加劑)100微升/羽。c.新城疫抗體效價監測
檢測方法按照國家高致病性新城疫診斷技術標準，進行微量血凝與血凝抑制試驗。d.檢測結果如圖I所示，說明本發明實施例I體外培養誘導淋巴細胞制備的MHC II類分子做為飼料添加劑飼喂動物，具有顯著的免疫增效作用。實施例2
a.以動物外周血為原料，按常規方法制備淋巴細胞單層。具體方法是無菌靜脈采取動物全血30毫升，加入抗凝劑0. 3毫升，分液漏斗中靜置2-3小時左右，收集紅細胞層以上的血漿，分裝于消毒離心管內，用平衡鹽液反復洗滌2-3次，離心速度800-1400轉/分，然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養，均勻混合后分裝于容量100毫升培養瓶或轉瓶中，塞緊瓶塞，置37°C恒溫箱中或轉瓶機中培養，經2-3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層。b.對淋巴細胞單層進行傳代培養在傳代培養細胞前，首先將培養瓶置于顯微鏡下觀察，以確定已生長成單層，即可進行細胞的傳代培養。c.當傳代淋巴細胞長成單層后，進行誘導培養。當傳代淋巴細胞長成單層后，加入溶解過濾后的刀豆蛋白A (Con A)、脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、人參皂苷(GS)進行誘導培養。加入量分別是刀豆蛋白A (Con A)3ug/mL、脂多糖(LPS) I. Oug/mL、植物血凝素(PHA) 0. 5ug/mL 和人參皂苷(GS) 0. 5ug/mL。d.誘導培養48小時后對產品進行檢驗；
將細胞培養物經凍融、超聲波破碎、過濾后取樣檢測。本實施例2所得培養物中MHCII類分子的含量為1000 2500ng/L。
MHCII類分子的含量、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1，檢驗結果如下 半成品檢驗半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、PH值等項檢測，檢測要求應符合中華
人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。成品檢驗成品進行MHCII類分子的含量檢測、外觀檢測、pH值、多肽含量、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒素等項檢測，檢測要求應符合中華人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。實驗例2
臨床實驗具體操作方法按以下步驟進行 a.新城疫(Iasota株)疫苗配制
取新城疫(Iasota株)疫苗，購自遼陽益康生物制品有限公司，按說明書的劑量配制，其中用量為50微升/羽。b.實驗分組免疫
將實驗雞群分為兩組，對照組和實驗組，均待雞群母源抗體為零時進行免疫。對照組正常免疫新城疫(Iasota株)疫苗，滴鼻或滴口 50微升/羽；實驗組正常免疫新城疫(Iasota株)疫苗，滴鼻或滴口 50微升/羽，同時口服本發明實施例2細胞培養物(做為飼料添加劑)100微升/羽。c.新城疫抗體效價監測
檢測方法按照國家高致病性新城疫診斷技術標準，進行微量血凝與血凝抑制試驗。d.檢測結果如圖2所示，說明本發明實施例2體外培養誘導淋巴細胞制備的MHC II類分子做為飼料添加劑飼喂動物，具有顯著的免疫增效作用。實施例3
a.以動物外周血為原料，按常規方法制備淋巴細胞單層；
具體方法是無菌靜脈采取動物全血30毫升，加入抗凝劑0. 3毫升，分液漏斗中靜置2-3小時左右，收集紅細胞層以上的血漿，分裝于消毒離心管內，用平衡鹽液反復洗滌2-3次,離心速度800-1400轉/分,然后用含30%小牛血清水解乳蛋白40毫升進行白細胞培養，均勻混合后分裝于容量100毫升培養瓶或轉瓶中，塞緊瓶塞，置37°C恒溫箱中或轉瓶機中培養，經2-3天，白細胞均勻貼壁，即制成淋巴細胞單層。b.對淋巴細胞單層進行傳代培養
在傳代培養細胞前，首先將培養瓶置于顯微鏡下觀察，以確定已生長成單層，即可進行細胞的傳代培養。
c.當傳代淋巴細胞長成單層后，進行誘導培養。當傳代淋巴細胞長成單層后，加入溶解過濾后的植物血凝素(PHA)、人參皂苷(GS)、美洲商陸(PWM)、腫瘤刺激劑(PMA)進行誘導培養。加入量分別是植物血凝素(PHA)5ug/mL、人參皂苷(GS) 2ug/mL、美洲商陸(PWM) I. 5ug/mL 和腫瘤刺激劑(PMA) I. 5ug/mL。d.誘導培養48小時后對產品進行檢驗；
將細胞培養物經凍融、超聲波破碎、過濾后取樣檢測。本實施例2所得培養物中MHCII類分子的含量為1000 2500ng/L。MHCII類分子的含量、半成品和成品的檢驗項目均同實施例1，檢驗結果如下 半成品檢驗半成品進行細菌內毒素、無菌檢查、PH值等項檢測，檢測要求應符合中華 人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。成品檢驗成品進行MHCII類分子的含量檢測、外觀檢測、pH值、多肽含量、特異活性試驗、蛋白質反應、無菌檢查、細菌內毒素、異常毒素等項檢測，檢測要求應符合中華人民共和國藥典2000年版二部附錄中的規定。實驗例3:
臨床實驗具體操作方法按以下步驟進行
a.禽流感H5N1 (Re-5株)疫苗配制
取禽流感H5N1 (Re-5株)疫苗，購自哈爾濱獸醫研究所，按說明書的劑量使用，其中用量為50微升/羽。b.實驗分組免疫
將實驗雞群分為兩組，對照組和實驗組，均待雞群母源抗體為零時進行免疫。對照組正常頸部注射免疫禽流感H5N1 (Re-5株)疫苗，500微升/羽；實驗組正常頸部注射免疫禽流感H5N1 (Re-5株)疫苗，500微升/羽，同時口服本發明實施例3細胞培養物(做為飼料添加劑)100微升/羽。c.禽流感H5N1 (Re-5株)抗體效價監測
檢測方法按照國家高致病性禽流感診斷技術標準，進行微量血凝與血凝抑制試驗。d.檢測結果如圖3所示，說明本發明實施例3體外培養誘導淋巴細胞制備的MHC II類分子做為飼料添加劑飼喂動物，具有顯著的免疫增效作用。本發明實施例所用絲裂原來源如下
刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、人參皂苷(GS)、美洲商陸(PWM)、腫瘤刺激劑(PMA)均購自Sigma公司。
權利要求
1.一種體外培養誘導淋巴細胞制備MHC II類分子的方法，其特征在于包括如下步驟 a.用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層； b.對淋巴細胞單層進行傳代培養； c.當傳代淋巴細胞長成單層后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人參皂苷、美洲商陸及腫瘤刺激劑中的至少兩種絲裂原誘導培養48小時，絲裂原加入量為5 10ug/mL ； d.將細胞培養物經超聲破碎后取樣檢測MHCII類分子的濃度。
2.一種如權利要求I所述體外培養誘導淋巴細胞制備MHC II類分子的方法制備的MHC II類分子，其特征是在提高動物免疫力飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明公開一種操作簡單、成本低、產量高、原料用量少、避免產品攜帶外源病毒及其他病源微生物的體外培養誘導淋巴細胞制備MHCII類分子的方法，包括如下步驟用脾臟或外周血制備淋巴細胞單層；對淋巴細胞單層進行傳代培養；當傳代淋巴細胞長成單層后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人參皂苷、美洲商陸及腫瘤刺激劑中的至少兩種絲裂原誘導培養48小時，絲裂原加入量為5～10ug/mL；將細胞培養物經超聲破碎后取樣檢測MHCⅡ類分子的濃度。所制備的MHCⅡ類分子，可在提高動物免疫力飼料添加劑中應用。
文檔編號A23K1/16GK102719507SQ201210232629
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者劉艷, 林洋, 江國托 申請人:江蘇三儀生物工程有限公司