專利名稱：共轉orca3/g10h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域的提高長春花類生物堿含量的方法，特別是一種共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法。
背景技術：
長春花(Catharanthus roseus)屬夾竹桃科多年生草本植物，可產生100多種具有抗癌活性的職類卩引哚生物堿(Terpenoid Indole Alkaloids, TIAs)。其中，長春堿(Vinblastine)和長春新堿(Vincristine)是重要的抗腫瘤藥用成分，也是目前應用最為廣泛的天然抗癌藥用成分。還有抗過敏藥用成分利血平(Reserpine)和降壓藥用成分阿瑪 堿(Ajmalicine)等。其中長春瑞賓是Pierre Fabre公司在20世紀90年代中期開發的一種比較新型的長春花生物堿類藥物，它是長春堿的一種半合成衍生物，是由一類長春花屬植物(Vinca rosea)所含的文多靈(Vindoline)和長春質堿(Catharanthine)化學半合成而來的一種藥物，目前在臨床上應用于治療乳腺癌、睪丸癌、卵巢上皮細胞癌、非小細胞性肺癌療效顯著。因此，長春花被認為是一種具有很高開發應用價值的藥用植物。然而，由于這些藥物在長春花中的含量極其微少(僅為百萬分之幾至十萬分之幾)，所以從天然植物中提取TIAs遠遠不能滿足市場需求，導致長春花藥用成分的供需矛盾相當嚴重(每年只能生產12kg長春堿和Ikg長春新堿)，使其價格極為昂貴(高達6000美元/克)，而用化學合成和半合成因成本太高而不具有商業價值。目前，全國市場上的長春花生物堿純品主要依靠進口。生物技術的興起和發展，為定向提高長春花中有效藥用成分含量及實現長春花生物堿的規模化生產提供了新的有效手段，從而已引起國內外的廣泛重視。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種共轉Orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法。本發明涉及的技術主要包括關鍵酶基因克隆、載體構建、遺傳轉化、分子檢測、生物堿提取及含量測定，建立了穩定提高長春花中部分生物堿含量的方法，為利用長春花大規模生產長春花類生物堿奠定堅實的基礎。本發明是通過以下技術方案實現一種共轉OrCa3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，該方法包括如下步驟(I)采用基因克隆方法獲得orca3和glOh基因；(2)分別構建 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nosterminator的表達盒,然后依次將所述表達盒置于雙元表達載體pCAMBIA2300中，構建成含orca3和glOh基因的植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3 ；(3)將所述植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3通過凍融法轉化根癌農桿菌，獲得含pCAMBIA2300+gl0h+orca3的根癌農桿菌工程菌；
(4)將所述工程菌轉化長春花并再生出植株，即得共轉OrCa3/gl0h基因的長春花植株。優選的，在所述步驟(I)中，從長春花基 因組中克隆所述orca3基因時采用的上游引物為 0RCA3-F1，其序列為 5’-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3’，下游引物為 0RCA3-R1，其序列為5’ -GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3’ ；從長春花基因組中克隆所述glOh基因時采用的上游引物為 G10H-F1，其序列為 5’-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3’，下游引物為 G10H-R1，其序列為 5’ -GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3’。優選的，在所述步驟(3)中，所述根癌農桿菌為EHA105。優選的，在所述步驟(4)中，所述轉化包括以下步驟( I)預培養長春花的外植體；(2)共培養所述工程菌與所述外植體；(3)誘導共培養后的長春花的愈傷組織及不定芽分化；(4)誘導生根和移栽所述長春花植株。優選的，在所述步驟(4)之后還包括以下步驟PCR檢測目的基因Orca3/gl0h的整合情況；HPLC-ELSD測定所述轉基因長春花中長春花類生物堿的含量，篩選獲得生物堿類含量提高的轉基因長春花植株。進一步優選的，所述PCR檢測的步驟為先設計合成35s-f/orca3-r和35s-f/gl0h_r引物，再進行DNA擴增,然后在紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為所述轉基因長春花植株。所述HPLC-ELSD測定長春花中生物堿含量的方法為當所述轉基因長春花株高生長到15cm時，選取幼嫩的葉片，于50°C烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末；稱取0. Ig所述干粉于2mL Eppendorf管中，加入ImL甲醇，浸泡3h，然后用超聲波40W處理30min，5000rpm離心lOmin，取上清用0. 4 y m的濾膜過濾，即可用于HPLC檢測長春花生物堿的含量；所述HPLC的流動相采用體積比為7:9:6的乙腈、甲醇和0. 7%二乙胺，所述二乙胺用磷酸調整到PH值為7. 2，所述流動相的流速為I. OmL/min，柱溫為35°C，所述ELSD檢測系統的漂移管溫度為35°C，放大系數為7，載氣壓力為5bar ;根據標準品的濃度和峰面積計算出樣品中的文多靈、長春質堿和長春堿的重量含量，再除以樣品的葉片干重，即可計算出文多靈、長春質堿和長春堿占樣品干重的百分含量。更進一步優選的，所述引物35s-f的序列為5’ -CGCACAATCCCACTATCCTT-3’ ；所述引物orca3_r的序列為5’-GCCCTTATACCGGITCCAAT-3’;所述引物 glOh-r 的序列為 5’-TGAAITCCTTGGCAGAATCC-3’。本發明采用基因工程手段，將長春花類生物堿合成途徑中的全局性轉錄因子orca3和作為關鍵酶的香葉醇_10_脫氫酶基因glOh在長春花中過量表達，獲得長春花類重要生物堿高產的轉基因長春花株系，該轉基因長春花中文多靈含量均比非轉基因長春花提高了 1.0-2. 2倍，長春質堿較非轉基因長春花提高了 I. 1-1. 9倍。本發明為解決長春花生物堿的供需矛盾提供了一種高產、穩定的長春花生物堿藥源，降低了長春花生物堿的生產成本，為今后利用轉基因長春花大規模生產長春花類生物堿打下了基礎。
圖I為長春花中文多靈、長春質堿和長春堿的含量檢測結果圖。圖2為雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3的表達框示意圖。圖3為轉基因長春花植株目的基因PCR檢測部分結果圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Samtoook等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例I長春花orca3和glOh基因的克隆I、長春花基因組總RNA的提取長春花基因組總RNA的提取是采用天根生化科技有限公司提供的RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒方法，其方法步驟是
(I)取50_100mg長春花葉片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450iiL RL (試劑盒提供，使用前要加入￠-巰基乙醇)，漩渦劇烈震蕩混勻；(2)將所有的溶液轉移至過濾柱CS上(試劑盒提供，過濾柱CS放在收集管中)，12，OOOrmp離心2-5分鐘，小心吸取收集管中的上清至RNase-free的離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細胞碎片沉淀；(3)緩慢加入0. 5倍上清體積的無水乙醇(通常為225 U L)，混勻(此時可能會出現沉淀)，將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3 (試劑盒提供)中，12，OOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將收集柱CR3放回收集管中；(4)向吸附柱CR3中加入350 ii L去蛋白液RWl (試劑盒提供)，12，OOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；(5) DNasel工作液的配制取10 ii L DNasel儲存液放入新的RNase-free離心管中，加入70 ii L RDD溶液，輕柔混勻；(6)向吸附柱CR3中央加入80 ii L的DNasel工作液，室溫靜置15分鐘；(7)向吸附柱CR3中加入350 ii L去蛋白液RW1，12，OOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；(8)向吸附柱CR3中加入漂洗液RW (試劑盒提供，使用前先檢查是否已加入乙醇)，室溫靜置2分鐘，12，OOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；(9)重復步驟(8);(10) 12，OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱CR3置于室溫放置2分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；(11)將吸附柱CR3放到一個新RNase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-100 u L RNase-free ddH20,室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，得到RNA溶液，凝膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。2、長春花orca3和glOh基因的克隆將所獲的長春花基因組總RNA通過反轉錄酶XL (AMV)反轉錄獲得第一鏈cDNA，根據長春花orca3和glOh基因的編碼序列，設計擴增出完整編碼框的上下游引物0RCA3-F1(5，-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3，)/0RCA3-R1(5，-GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3 ’)和 GlOH-Fl(5，-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3，)/GlOH-Rl(5，-GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3，)，并在上游和下游引物上分別弓IA限制性內切酶位點(orca3兩端分別為SpeI和Bst EILglOh兩端分別為NcoI和Bst EII),以便構建含單個基因的CaMV 35S-orca3_nos terminator和CaMV 35S-gl0h-nos terminator表達盒。以所述的第一鏈cDNA為模板,經PCR擴增后進行測序。DNA序列測定由上海英駿生物技術服務有限公司測序完成。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的長春花orca3(NCBI登錄號EU072424)和glOh(NCBI登錄號AJ251269)基因的編碼序列一致。本實施例采用基因克隆方法從長春花中獲得序列正確的生物堿合成關鍵酶基因glOh和全局轉錄因子orca3,為通過共轉orca3和glOh基因提高長春花中長春花類生物堿的含量提供了重要的關鍵酶基因。實施例2含orca3和glOh基因的植物雙元表達載體的構建I、中間載體 pMDT18_gl0h 和 pMDT18_orca3 的構建 選用pMDT18載體(Takara，Dalian)為基本元件，構建中間載體pMDT18_gl0h和pMDT18-orca3。具體地，通過高保真酶分別擴增orca3和glOh基因全長，同時在orca3基因的前后分別引入SpeI和Bst EII酶切位點，在glOh基因兩端分別引入NcoI和Bst EII酶切位點。將帶有酶切位點的基因全長分別通過連接酶連接到PMDT18載體上，由上海英駿生物技術服務有限公司測序確認基因的正確性。2、單基因植物表達盒 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nosterminator 的構建以pCAMBIA1304為表達載體，將實施例I中orca3和glOh基因連入其對應的酶切位點位置。具體地，分別用SpeI和Bst EII雙酶切中間載體pMDT18-orca3和表達載體PCAMBIA1304，用 NcoI 和 Bst EII 雙酶切中間載體 pMDT18_gl0h 和表達載體 pCAMBIA1304。回收orca3和glOh基因片段和pCAMBIA1304載體大片段，連接后轉化，挑取單克隆，提取質粒做PCR檢測和酶切驗證。此方法可獲得分別含有orca3基因和glOh基因的單基因表達盒 CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nos terminator。3、植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3的構建將以上構建的CaMV 35S-gl0h_nos terminator 和 CaMV 35S-orca3_nosterminator表達盒依次置于表達載體pCAMBIA2300中即可得到植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3。具體地，用 SmaI 和 PstI 雙酶切 pCAMBIA2300 表達載體，用 SmiI和PstI雙酶切CaMV 35S-gl0h-nos terminator表達盒，分別回收載體片段和表達盒片段連接，得到含有glOh基因的表達載體pCAMBIA2300+gl0h ;用SmaI和PstI雙酶切上述pCAMBIA2300+gl0h,用 SmiI 和 PstI 雙酶切 CaMV 35S-orca3_nos terminator,連接后得到含有雙基因的表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3，其表達框示意圖如圖2所示。本實施例將長春花生物堿的生物合成途徑關鍵酶基因orca3和glOh可操作性地連接于表達調控序列，形成含orca3和glOh基因的植物表達載體，該表達載體用于通過代謝工程策略來提高長春花中長春花類生物堿的含量。實施例3根癌農桿菌介導orca3和glOh基因轉化長春花獲得轉基因長春花植株I、含orca3和glOh基因雙元植物表達載體根癌農桿菌工程菌的獲得將實施例2中含orca3和glOh基因的植物雙元表達載體轉入根癌農桿菌(如EHA105，為市場有公開出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購得，菌株編號為 Gambar I),并進行PCR驗證。2、根癌農桿菌介導orca3和glOh基因轉化長春花(I)外植體的預培養本發明所采用的長春花種子購自PanAmerican Seed公司，太平洋系列樓桃紅色 (Pacifica Cherry Red,PCR)。長春花種子經 75% 酒精消毒 lmin, 20%NaC10 消毒 5min,無菌水沖洗3次，用濾紙吸干多余的水分，然后接種于MS培養基上，(25±2)°C、光照時間16h/ d、光照強度2，OOOlx培養3 4d，剪取獲得5mm大小無菌苗下胚軸用于轉化。(2)農桿菌與外植體的共培養將剪好的長春花下胚軸放入無菌的EP管中，加入含AS的1/2MS液體培養液將其懸浮，無菌密封后，超聲波處理功率80W，處理時間IOmin。而后將超聲處理后的下胚軸浸入活化好的含orca3和glOh基因植物雙元表達載體的農桿菌菌液中30min，棄去菌液，用無菌濾紙將表面菌液吸干。最后將下胚軸平鋪于添加了 lOOymol/L AS的1/2MS共培養培養基上,在26°C遮光的恒溫培養箱中共培養2d。 (3)長春花愈傷組織的誘導及不定牙的分化將共培養后的長春花下胚軸以平臥方式接種于愈傷組織誘導培養基(附加激素 2，4-DO. lmg/L、NAA 0. lmg/L和頭孢霉素500mg/L)上，培養室中培養IOd以后，觀察愈傷組織生長狀態，統計愈傷組織的生長率；將培養IOd的愈傷組織轉接到脫分化培養基(附加 6-BA 2. 5mg/L、NAA 0. 25mg/L和頭孢霉素500mg/L的MSCP分化培養基)上，進行脫分化培養；IOd后再將脫分化了的外植體轉到分化培養基(附加6-BA lmg/L、IAA 0. lmg/L和頭孢霉素500mg/L的MSCP)上，每IOd用同樣的分化培養基繼代，直到分化出芽，培養室中培養 20d以后，觀察不定芽的分化，統計不定芽的分化率；長春花愈傷組織的誘導和不定芽的分化均以MSCP為基本培養基，MSCP培養基MS 粉 4. 43g/L,鹿糖 30g/L,植物凝膠粉 3g/L,水解酪蛋白(Casein hydrolysate, CH) 0. 15g/L, 脯氨酸(Proline) 0. 25g/L，pH 值為 5.8。(4)生根和移栽修剪再生出芽的外植體，去除四周未分化的愈傷組織，移入1/2MS培養基(附加頭孢霉素500mg/L)，繼續誘導生根。培養室中培養I個月以后，待分化的幼苗生長出發達的根系，從培養罐中小心取出植株，洗凈附著的培養基后移栽到壤土中培養。3、轉基因長春花植株的PCR檢測根據目的基因所在表達盒p35s-orca3_nos和p35s-gl0h_nos序列分別設計正向引物 35s-f(5’ -CGCACAATCCCACTATCCTT-3’ )和反向引物 orca3_r(5’ -GCCCTTATACCGGTTCC AAT-3’)、gl0h-r(5’ -TGAATTCCTTGGCAGAATCC-3’ )對目的基因進行檢測。結果表明，利用所設計的PCR特異引物，能分別擴增出400bp和600bp的特異DNA片段，如圖3所示，其中 M代表DL5000marker ;+代表pCAMBIA2300+gl0h+orca3質粒；w代表非轉基因長春花；G01、 G02、G03、G04、G05、G06 和 G07 代表轉 pCAMBIA2300+gl0h+orca3 基因長春花植株；而以非轉化長春花基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。本實施例將所述的植物表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化長春花的含 orca3和glOh基因植物雙元表達載體的根癌農桿菌菌株，利用所構建的根癌農桿菌菌株轉化長春花，獲得經PCR檢測的轉基因長春花植株。轉基因長春花植株的獲得為篩選獲得較高生物堿含量的長春花株系提供了直接材料。實施例4利用HPLC-ELSD測定轉基因長春花中長春花類生物堿的含量I、HPLC-ELSD條件及系統適用性以及標準溶液的配制HPLC :采用Hitachi L-2000系統控制，流動相為乙腈甲醇0· 7% 二乙胺(用磷酸調整pH=7. 2，抽濾，超聲波除去氣泡)=7:9:6，流速為LOmL/min，柱溫為35°C ；ELSD :檢測系統采用Water Alliance 2420，蒸發光散射檢測器漂移管溫度35°C， 放大系數(gain)為7,載氣壓力5bar ；精密稱取文多靈、長春質堿、長春堿標準品(Sigma公司)I. Omg用ImL甲醇完全溶解，得到lmg/mL標準品溶液，保存于-20°C備用；本發明中流動相為乙腈甲醇0. 7% 二乙胺(用磷酸調整pH=7. 2，抽濾，超聲波除去氣泡)=7:9:6，流速為I. OmL/min,柱溫為35°C。文多靈、長春質堿和長春堿出峰時間分別為 10. lmin、14. Imin 和 17. 6min。
2、標準曲線的制作將所述對照品溶液在相應色譜條件下分別進樣2 μ L、4 μ L、6 μ L、8 μ L和10 μ L， 記錄圖譜及色譜參數，分別以峰面積(Y)對標準品含量(X，yg)進行回歸分析。3、樣品的制備和生物堿含量的測定生物堿的提取過程基于Tikhomiroff C. (2002)等報道的方法待長春花株高生長到15cm左右，選取幼嫩的葉片，于50°C烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末。稱取O. Ig干粉于2mL Eppendorf管中，加入ImL甲醇,浸泡3h,然后用超聲波40W處理30min, 5，OOOrpm離心lOmin，取上清用O. 4μ m的濾膜過濾，即可用于HPLC檢測長春花生物堿的含量。文多靈、 長春質堿和長春堿出峰時間分別為10. lmin、14. Imin和17. 6min,根據標準品的濃度和峰面積計算出樣品中的文多靈、長春質堿和長春堿的含量(mg)，再除以樣品的葉片干重(g)， 從而計算出文多靈、長春質堿和長春堿占樣品干重的百分含量。在本發明中轉orca3和glOh基因得到的陽性株系G01-G05中，文多靈和長春質堿的含量顯著提高，長春堿也有不同程度的提高。轉基因長春花中文多靈含量均比非轉基因長春花提高了 I. 0-2. 2倍，長春質堿較非轉基因長春花提高了 I. 1-1. 9倍。本實施例采用HPLC-ELSD法測定了轉基因長春花中文多靈、長春質堿和長春堿的含量，采用轉化全局轉錄因子orca3和關鍵酶基因glOh基因的代謝工程策略獲得了文多靈和長春質堿高產的長春花植株，為規模化生產文多靈和長春質堿提供了一種新的方法。
權利要求
1.一種共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (1)采用基因克隆方法獲得orca3和glOh基因； (2)分別構建CaMV 35S-orca3_nos terminator 和 CaMV 35S-gl0h_nos terminator 的表達盒，然后依次將所述表達盒置于雙元表達載體PCAMBIA2300中，構建成含orca3和glOh基因的植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+orca3 ； (3)將所述植物雙元表達載體pCAMBIA2300+gl0h+Orca3通過凍融法轉化根癌農桿菌，獲得含pCAMBIA2300+gl0h+orca3的根癌農桿菌工程菌； (4)將所述工程菌轉化長春花并再生出植株。
2.根據權利要求I所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，從長春花基因組中克隆所述orca3基因時采用的上游引物為 0RCA3-F1，其序列為 5’-ACTAGTATGTCCGAAGAAATCAT-3’，下游引物為 0RCA3-R1，其序列為5’ -GGTCACCTTAATATCGTCTCTTCT-3’ ；從長春花基因組中克隆所述glOh基因時采用的上游引物為 G10H-F1，其序列為 5’-ACCAGTATGGATTACCTTACCAT-3’，下游引物為 G10H-R1，其序列為 5’ -GGTCACCAAGGGTGCTTGGTACAGC-3’。
3.根據權利要求I所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述根癌農桿菌為EHA105。
4.根據權利要求I所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述轉化包括以下步驟 (1)預培養長春花的外植體； (2)共培養所述工程菌與所述外植體； (3)誘導共培養后的長春花的愈傷組織及不定芽分化； (4)誘導生根和移栽所述長春花植株。
5.根據權利要求I所的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，在所述步驟(4)之后還包括以下步驟PCR檢測目的基因orCa3/gl0h的整合情況；HPLC-ELSD測定所述轉基因長春花中長春花類生物堿的含量，篩選獲得生物堿類含量提高的轉基因長春花植株。
6.根據權利要求5所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，所述PCR檢測的步驟為先設計合成35s-f/orca3-r和35s-f/gl0h_r引物，再進行DNA擴增，然后在紫外線下觀察到目的條帶的陽性株系即為所述轉基因長春花植株。
7.根據權利要求6所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于 所述引物 35s-f 的序列為 5’ -CGCACAATCCCACTATCCTT-3’ ； 所述引物 orca3-r 的序列為 5’ -GCCCTTATACCGGITCCAAT-3 ’ ； 所述引物 glOh-r 的序列為 5’ -TGAAITCCTTGGCAGAATCC-3’。
8.根據權利要求5所述的共轉orca3/gl0h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，其特征在于，所述HPLC-ELSD測定長春花中生物堿含量的方法為當所述轉基因長春花株高生長到15cm時，選取幼嫩的葉片，于50°C烘箱中烘至恒重，然后磨成粉末；稱取0. Ig所述干粉于2mL Eppendorf管中，加入ImL甲醇,浸泡3h,然后用超聲波40W處理30min,.5000rpm離心lOmin，取上清用0. 4 y m的濾膜過濾，即可用于HPLC檢測長春花生物堿的含量；所述HPLC的流動相采用體積比為7:9:6的乙腈、甲醇和0. 7% 二乙胺，所述二乙胺用磷酸調整到pH值為7. 2，所述流動相的流速為I. OmL/min,柱溫為35°C，所述ELSD檢測系統的漂移管溫度為35°C，放大系數為7，載氣壓力為5bar ;根據標準品的濃度和峰面積計算出樣品中的文多靈、長春質堿和長春堿的重量含量，再除以樣品的葉片干重，即可計算出文多靈、長春質堿和長春堿占樣品干重的百分含量。
全文摘要
本發明涉及一種共轉orca3/g10h基因提高長春花中長春花類生物堿含量的方法，所述方法包括如下步驟克隆orca3基因和g10h基因；分別構建orca3基因和g10h基因的表達盒，然后依次將表達盒置于雙元表達載體pCAMBIA2300中，構建含orca3和g10h基因的植物雙元表達載體；通過凍融法轉化根癌農桿菌獲得工程菌；通過農桿菌介導法轉化長春花并再生出植株；PCR檢測基因orca3/g10h的整合情況測定轉基因長春花中長春花類生物堿的含量，篩選獲得生物堿類含量提高的轉基因長春花植株。本發明提供了一種高產、穩定的長春花生物堿藥源，有利于大規模、低成本生產長春花類生物堿。
文檔編號A01H5/00GK102703501SQ20121016653
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者唐克軒, 徐菲, 潘琪芳, 王名雪, 趙靜雅 申請人:上海交通大學