專利名稱：一種玉米單倍體加倍方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地涉及農業育種領域，更具體地，涉及ー種高效低耗、能夠使加倍率顯著提高的玉米單倍體加倍技木。
背景技術：
玉米中采用雙單倍體育種(Doubled haploid，DH)可以縮短自交系選育時間，加快育種進程，已經成為玉米育種的主要方法。獲得足夠單倍體和加倍獲得DH系是DH育種的基本環節。然而，玉米單倍體自然加倍比較困難，目前，單倍體的成功加倍是單倍體育種技術大規模應用的限制因素，尤其是雄穗的成功加倍。單倍體加倍分為自然加倍和藥物加倍，許多材料的自然加倍率低于5%，有些材料甚至不發生自然加倍，因此采取人工處理提高加倍率來滿足育種與相關研究的需要顯得尤為重要。
人工處理加倍的方法和試劑較為多樣，其中秋水仙素是常用的加倍試劑，且多采用浸芽法進行處理。因為浸芽法簡單易行，而且具有較高的加倍效率。但秋水仙素的毒性很大，對幼苗易造成嚴重傷害，很容易影響單倍體的加倍效率。另外，整體來看，浸種法加倍效率并不理想。主要是浸種法對植株傷害較為嚴重，存活率較低；并且，前人所用的浸芽法都是將整個幼苗都浸泡在秋水仙素溶液中，不僅幼芽吸收秋水仙素，而且幼苗根部也吸收了大量的秋水仙素溶液，從而影響了根系的生長，造成大量幼苗死亡。因此，探索一種既能減少幼苗死亡又能提高玉米單倍體加倍率的加倍方法顯得尤為重要。
發明內容
本發明的目的在于ー種既能減少幼苗死亡又能提高玉米單倍體加倍率的加倍方法。發明人通過大量實驗研究，發現了一種高效低耗的植物單倍體加倍技術，包括以下步驟1)切除植物單倍體幼芽胚芽鞘尖端；2)用秋水仙素配以ニ甲基亞砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的植物單倍體幼芽的上部，得到染色體加倍的植物幼芽。上述植物單倍體加倍技術，命名為幼芽上部浸泡法。由于在該方法中，植物單倍體幼苗僅上部(即胚芽部分)和秋水仙素溶液接觸，因而受傷害相對較小，存活率得以提高，同時加倍效果也非常好，具有良好的應用價值。本發明提供的植物單倍體加倍方法，所述的植物為單子葉植物或雙子葉植物。優選地，所述單子葉植物為玉米。在本發明中，所述的秋水仙素混合液的濃度為0. 4-0. 8mg/mL，并配以1% -5%ニ甲基亞砜；秋水仙素混合液的使用量為300-1000 μ I。在本發明中，所述的秋水仙素混合液的濃度為0.6mg/mL，并配以2%ニ甲基亞砜；秋水仙素混合液的使用量為500 μ I。進ー步地，在本發明的方法所述浸泡步驟中，僅留胚芽部分浸泡在混合液中，根部露在外部。進ー步，本發明提供了一種高效低耗的玉米單倍體加倍方法，包括以下步驟I)切除玉米單倍體幼芽胚芽鞘頂端；2)用秋水仙素配以ニ甲基亞砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽的上部，通過該部分浸泡措施，得到染色體加倍的玉米幼芽。該方法中用秋水仙素混合液浸泡過程中，首先在每個離心管中加入300-1000 μ L
O.4-0. 8mg/mL的秋水仙素溶液，所述秋水仙素溶液中還配有I % _5 % ニ甲基亞砜，緊接著將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽根部朝上倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，整個操作過程要求在18-25°C之間進行，浸泡6-10h。
優選地，所述的秋水仙素混合液的濃度為0. 6mg/mL，并配以2%ニ甲基亞砜；秋水仙素混合液的使用量為500 μ I ;整個操作過程要求在23°C進行,浸泡8h。在用秋水仙素混合液浸泡過程中，為了防止幼芽根部脫水，可用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部，可達到更好的效果，實現更好的存活率。進ー步，本發明所提供的玉米單倍體加倍方法由如下步驟組成I.種子發芽將單倍體種子清洗干凈，均勻地擺放在鋪有濕毛巾的發芽盤中，放置在20-28°C的適宜環境中暗光培養3-5天，并及時補充水分。2.胚芽鞘頂端切除待玉米單倍體幼芽長至l-3cm時，切除玉米單倍體幼芽的胚芽鞘尖端且不損傷真葉和生長點，得到切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽。3.幼芽浸泡取離心管，在每個離心管中加入300-1000 μ L0. 4-0. 8mg/mL的秋水仙素溶液(配以1% _5%ニ甲基亞砜)，將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部。整個操作過程要求在18-25°C之間進行，浸泡6-10h。優選地，幼芽浸泡時所用的秋水仙素混合溶液中,含終濃度為O. 6mg/mL的秋水仙素和2%的ニ甲基亞砜。整個操作過程溫度為22-25°C，浸泡時間為8-10h。4.清水沖洗將幼芽從離心管中取出，放進合適的發芽盒中，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙素溶液倒進固定的廢液桶中并處理。清水沖洗時間I小時以上。5.緩苗將幼芽移栽在育苗缽中，并放置在陰涼通風處進行緩苗。緩苗期間注意適時適量澆水。緩苗期間溫度20-28°C。6.移栽待幼苗長至2-3葉期的時候，及時將其移栽在試驗田中。移栽前，向育苗缽中澆足量的水分，使營養土能夠凝成一団，不至于從幼苗上脫落。然后將其移栽在條穴中，移栽后，及時大量澆水，確保成活。待苗情穩定之后，參照大田模式進行田間管理。所述的玉米單倍體幼芽從芽的基部到芽尖端的長度為I. 5cm-2. 5cm,或L 5cm,或2. 0cm,或 2. 5cm。本發明的方法中，使得幼芽從胚芽起浸泡約O. 5-2. Ocm的高度，從而避免使除了胚芽之外的其他部位(尤其是根部)受到傷害。本發明所提供的玉米單倍體加倍技術能顯著地提高玉米單倍體的成活率和結實率，成活率高達70%以上，遠遠高于作為対照的成活率(一般50%以下)，結實率10%以上，遠遠高于對照的結實率(一般5%左右)，而且減少秋水仙素的使用量5倍以上。此方法解決了單倍體加倍過程中成活率低和結實率低這ー關鍵技術難題，從而大大提高了單倍體加倍效率，實現單倍體育種技術的規模化和工程化。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的化學試劑、種子均為常規市售，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例I玉米單倍體加倍方法與對照試驗(I)本實施例所提供的玉米單倍體加倍方法由如下步驟組成I.種子發芽將單倍體種子清洗干凈，均勻地擺放在鋪有濕毛巾的發芽盤中，放置在25°C的培養箱中暗光培養4天，并及時補充水分。2、胚芽鞘頂端切除待玉米單倍體幼芽長至2cm吋，切除玉米單倍體幼芽的胚芽鞘尖端且不損傷真葉和生長點，得到切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽。3、幼芽浸泡取離心管，在每個離心管中加入500 μ L O. 6mg/mL的秋水仙素溶液(配以終濃度為2. 0%ニ甲基亞砜)，緊接著將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部。整個操作過程在23°C進行，浸泡8h。4、清水沖洗將幼芽從離心管中取出，放進合適的發芽盒中，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙素溶液倒進固定的廢液桶中并處理。清水沖洗時間13h。5、緩苗將幼芽移栽在育苗缽中，并放置在陰涼通風處進行緩苗。緩苗期間注意適時適量澆水。緩苗期間溫度25°C。6、移栽待幼苗長至2-3葉期的時候，及時將其移栽在試驗田中。移栽前，向育苗缽中澆足量的水分，使營養土能夠凝成一団，不至于從幼苗上脫落。然后將其移栽在條穴中，移栽后，及時大量澆水，確保成活。待苗情穩定之后，田間管理與大田基本相同。7、對照組I :取O. 6mg/mL濃度的秋水仙素(配以2. 0%ニ甲基亞砜)，處理100粒單倍體幼芽，將幼芽整個部分包括幼芽根部浸泡在秋水仙素混合液中，需要秋水仙素混合液 300mL。而本發明方法用0.6mg/mL濃度的秋水仙素(配以終濃度為2.0% ニ甲基亞砜)，處理100粒單倍體幼芽，需要秋水仙素混合液50mL，即每I粒單倍體幼芽需要秋水仙素混合液500 μし結果表明本發明實施例I所提供的玉米單倍體成活率為75%，而對照組I的成活率為45%，本發明實施例I玉米單倍體的結實率15%，對照組I的結實率為5%。可見使用本發明方法較幼芽全部浸泡法能夠減少秋水仙素使用量5倍，且玉米單倍體加倍過程中成活率和結實率均顯著高于對照組，取得了優異的效果。實施例2玉米單倍體加倍方法與對照試驗(2)本實施例所提供的玉米單倍體加倍方法由如下步驟組成I、種子發芽將單倍體種子清洗干凈，均勻地擺放在鋪有濕毛巾的發芽盤中，放置在20°C的培養箱中暗光培養5天，并及時補充水分。2、胚芽鞘頂端切除待玉米單倍體幼芽長至3cm吋，切除玉米單倍體幼芽的胚芽鞘尖端且不損傷真葉和生長點，得到切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽。
3、幼芽浸泡取離心管，在每個離心管中加入300μ L0. 8mg/mL的秋水仙素溶液(配以終濃度為1% ニ甲基亞砜)，緊接著將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部。整個操作過程在18°C進行。浸泡10h。4、清水沖洗將幼芽從離心管中取出，放進合適的發芽盒中，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙素溶液倒進固定的廢液桶中并處理。清水沖洗時間2h。5、緩苗將幼芽移栽在育苗缽中，并放置在陰涼通風處進行緩苗。緩苗期間注意適時適量澆水。緩苗期間溫度20°C。6、移栽待幼苗長至2-3葉期的時候，及時將其移栽在試驗田中。移栽前，向育苗缽中澆足量的水分，使營養土能夠凝成一団，不至于從幼苗上脫落。然后將其移栽在條穴中，移栽后，及時大量澆水，確保成活。待苗情穩定之后，田間管理與大田基本相同。7、對照組2 :用O. 8mg/mL濃度的秋水仙素(配以終濃度為I. O %ニ甲基亞砜)處 理幼芽，將幼芽整個部分浸泡在秋水仙素混合液中，其他步驟和參數處理同本實施例處理玉米單倍體幼芽樣品，作為對照，對其各指標進行檢測，并與本實施例效果進行對比。結果表明本發明實施例2所提供的玉米單倍體成活率為80%，而對照組2的成活率為49 %，本發明實施例2玉米單倍體的結實率20 %，對照組2的結實率為6 %。可見本發明的幼芽上部浸泡法能夠比幼芽全部浸泡法在玉米單倍體加倍過程中成活率和結實率方面獲得顯著提高。實施例3玉米單倍體加倍方法與對照試驗(3)本實施例所提供的玉米單倍體加倍方法由如下步驟組成I、種子發芽將單倍體種子清洗干凈，均勻地擺放在鋪有濕毛巾的發芽盤中，放置在28°C的培養箱中暗光培養3天，并及時補充水分。2、胚芽鞘頂端切除待玉米單倍體幼芽長至3cm吋，切除玉米單倍體幼芽的胚芽鞘尖端且不損傷真葉和生長點，得到切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽。3、幼芽浸泡取離心管，在每個離心管中加入500μ L0. 4mg/mL的秋水仙素溶液(配以終濃度為5% ニ甲基亞砜)，緊接著將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面。為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部。整個操作過程要求在25°C進行，浸泡6h。4、清水沖洗將幼芽從離心管中取出，放進合適的發芽盒中，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙素溶液倒進固定的廢液桶中并處理。清水沖洗時間10h。5、緩苗將幼芽移栽在育苗缽中，并放置在陰涼通風處進行緩苗。緩苗期間注意適時適量澆水。緩苗期間溫度28°C。6、移栽待幼苗長至2-3葉期的時候，及時將其移栽在試驗田中。移栽前，向育苗缽中澆足量的水分，使營養土能夠凝成一団，不至于從幼苗上脫落。然后將其移栽在條穴中，移栽后，及時大量澆水，確保成活。待苗情穩定之后，田間管理與大田基本相同。7、對照組3 :用500 μ LU. 5mg/mL濃度的秋水仙素(配以終濃度為2. 0% ニ甲基亞砜)處理幼芽，以同樣步驟和同樣的參數處理對照玉米單倍體幼芽樣品，作為對照，對其各指標進行檢測，并與本發明進行對比。結果表明本發明實施例3所提供的玉米單倍體成活率為73%，而對照組3的成活率為45%，本發明實施例3玉米單倍體的結實率13%，對照組3的結實率為5%。可見本發明選擇的秋水仙素濃度較其他濃度的秋水仙素混合液能夠顯著提高玉米單倍體加倍過程中的成活率和結實率。上述實施例及其結果表明本發明所提供的玉米單倍體加倍技術能顯著地提高玉米單倍體的成活率和結實率，成活率高達70%以上，遠遠高于作為対照的成活率(一般50%以下)，結實率10%以上，遠遠高于對照的結實率(一般5%左右)，而且減少秋水仙素 的使用量5倍以上。本發明的方法解決了單倍體加倍過程中成活率低和結實率低這ー關鍵技術難題，從而大大提高了單倍體加倍效率，實現單倍體育種技術的規模化和工程化。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種植物單倍體加倍方法，其特征在于，包括以下步驟 1)切除植物單倍體幼芽胚芽鞘尖端； 2)用秋水仙素和二甲基亞砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的植物單倍體幼芽的胚芽部分，通過該部分浸泡措施，得到染色體加倍的幼芽。
2.如權利要求I所述的單倍體加倍方法，其特征在于，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
3.如權利要求I或2任意一項所述的單倍體加倍方法，其特征在于，所述秋水仙素和二甲基亞砜混合液中，秋水仙素的終濃度為0. 4-0. 8mg/mL，二甲基亞砜終濃度為1% -5%;秋水仙素混合液的使用量為300-1000 ii I。
4.如權利要求I或2任意一項所述的單倍體加倍方法，其特征在于，所述浸泡步驟中，僅留單倍體幼芽的胚芽部分浸泡在混合液中，幼芽根部露在混合液外。
5.一種玉米單倍體加倍方法，其特征在于，包括以下步驟 1)切除玉米單倍體幼芽胚芽鞘尖端； 2)將已經切除了胚芽鞘尖端的幼芽倒著放入離心管中，用秋水仙素配以二甲基亞砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽的胚芽部份，通過該部分浸泡措施，得到染色體加倍的玉米幼芽。
6.如權利要求5所述的玉米單倍體加倍方法，其特征在于，所述用秋水仙素混合液浸泡過程中，每個離心管中加入300-1000 ii L0. 4-0. 8mg/mL的秋水仙素溶液，所述秋水仙素溶液中還配有終濃度為1% -5%的二甲基亞砜；將已經切除胚芽鞘尖端的幼芽根部朝上倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，整個操作過程要求在18-25°C之間進行，浸泡6-10h。
7.如權利要求5或6任意一項所述的玉米單倍體加倍方法，其特征在于用秋水仙素混合液浸泡過程中，為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部。
8.—種玉米單倍體加倍方法，由下述步驟組成 1)種子發芽將單倍體種子清洗干凈，均勻地擺放在鋪有濕毛巾的發芽盤中，放置在20-28°C的適宜環境中暗光培養3-5天，并及時補充水分； 2)胚芽鞘頂端切除待玉米單倍體幼芽長至l_3cm時，切除玉米單倍體幼芽的胚芽鞘尖端且不損傷真葉和生長點，得到切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽； 3)幼芽浸泡取離心管,在每個離心管中加入300-1000ii L秋水仙素混合溶液,其中含終濃度為0. 4-0. 8mg/mL的秋水仙素和1% _5%的二甲基亞砜，將已經切除胚芽鞘頂端的幼芽倒著放進離心管中，使幼芽的胚芽部分浸泡在秋水仙素溶液中，而幼芽根部露在外面，為了防止幼芽根部脫水，用濕紙巾或濕毛巾覆蓋幼苗根部，整個操作過程要求在18-25°C之間進行，浸泡6-10h ; 4)清水沖洗將幼芽從離心管中取出，放進發芽盒中，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙素溶液倒進固定的廢液桶中并處理，清水沖洗時間I小時以上； 5)緩苗將幼芽移栽在育苗缽中，并放置在陰涼通風處進行緩苗，緩苗期間注意適時適量澆水，緩苗期間溫度20-28°C ； 6)移栽待幼苗長至2-3葉期的時候，及時將其移栽在試驗田中；移栽前，向育苗缽中澆足量的水分，使營養土能夠凝成一團，不至于從幼苗上脫落；然后將其移栽在條穴中，移栽后，及時大量澆水，確保成活；待苗情穩定之后，參照大田模式進行田間管理。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟3)所述秋水仙素混合溶液中，含終濃度為0. 6mg/mL的秋水仙素和2%的二甲基亞砜。
10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟3)所述整個操作過程溫度為.22-25°C，浸泡時間為8-10h。
全文摘要
本發明提供了一種玉米單倍體加倍方法，包括以下步驟1)切除玉米單倍體幼芽胚芽鞘尖端；2)用秋水仙素配以二甲基亞砜的混合液浸泡所述切除胚芽鞘尖端的玉米單倍體幼芽的胚芽部分，得到染色體加倍的玉米幼芽。本發明所提供的玉米單倍體加倍技術能顯著地提高玉米單倍體的成活率和結實率，成活率高達70％以上，遠遠高于作為對照的成活率(一般50％以下)，結實率10％以上，遠遠高于對照的結實率(一般5％左右)，而且減少秋水仙素的使用量5～6倍。該方法應用于單倍體育種體系中，將有效地推進玉米育種技術的變革，實現單倍體育種的規模化和工程化。
文檔編號A01H1/08GK102657080SQ201210146920
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者劉新香, 段民孝, 王元東, 趙久然 申請人:北京市農林科學院