專利名稱：一種白芨的快速繁殖方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，涉及植物組織培養技術，具體地說是一種白芨的組織培養方法。
背景技術：
植物是藥物的天然寶庫，人們利用藥用植物的歷史源遠流長，全世界約有75%的人口以植物作為治療預防疾病的藥物來源(邢建民，2001)。人類已經從植物中發現了許多具有高度生理活性的藥物，目前從植物來源的藥物占藥物總量的25%以上(鄭光植， 1987)。我國的傳統中草藥已有數千年的歷史，至今仍在我國和許多國家和地區廣為使用。 但由于傳統的中草藥獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價的，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導致物種的瀕危甚至滅絕。同時隨著自然生態環境的日益破壞，也進一步導致藥用植物資源的匱乏。生物技術的蓬勃發展為從根本上改變傳統藥材的生產提供了一個嶄新的方法，植物組織和細胞培養技術則是其中一個重要的手段。我國自1964年羅士韋教授首先報道了人參組織培養獲得成功的研究成果以來，許多科學家先后從事了多種藥用植物的組織培養研究。至今，我國藥用植物的組織培養研究迅速發展。目前，世界各國對植物的藥用開發和研究都十分重視，就以美國來說，其成藥中有 47%是以植物為原料制成的(謝啟昆，1986)。為了解決藥用植物的供需矛盾，人們采用人工栽培的方法擴大藥源。但在人工栽培的藥用植物中，有不少名貴藥材等生產周期較長，如人參、黃連，如果以常規方法育種或育苗，需要花費很長的時間；另有一些藥用植物如貝母、 番紅花等，因繁殖系數小、耗種量大，導致育種速度很慢，生產成本增加。利用植物的有性繁殖方式對其有效成分含量波動比較大，所以利用植物組織培養技術解決藥用植物的植株再生與繁殖問題迫在眉睫。近年來，國內外在這方面已做了大量工作，已成功離體培養獲得試管植株的藥用植物至少有200種，如云南黑節草、延齡草、高山紅景天、莪術、水母雪蓮、星花繡線菊、溪黃草、玉葉金花、遼東榴木等；其中包括一些具有抗癌有效成分的珍稀植物，如紅豆杉、艾、黃楊、大戟屬植物、長春花、米仔蘭、狗牙花和香榧等。白芨，又名白給，屬于蘭科。多年生草本，喜溫暖、陰涼和較陰濕的環境，不耐寒，高 30 50cm。葉4 5枚，基部互相套疊成莖狀，中央抽出花葶。總狀花序具數朵花；花紫色或淡紅色，直徑約5厘米，由3枚萼片、2枚花瓣和I枚特化的唇瓣組成；唇瓣3裂，上面有縱褶片；雄蕊與花柱合生而成合蕊柱，合蕊柱頂端有一個花藥，前上方有一個柱頭凹穴。地下有粗厚的根狀莖，如雞頭狀，富粘性，含白及膠質，即白及甘露聚糖，可供藥用，有止血補肺、 生肌止痛之效，也可供作糊料。白及屬共有6種，均產于東亞。研究表明，白芨的假鱗莖具有很高的藥用成分，主要含有富含淀粉、葡萄糖、揮發油、粘液質等，外用涂擦，可消除臉上痤瘡般下的痕跡，讓肌膚光滑無痕。球莖含白及膠質、淀粉、揮發油等；藥用，有收效、補肺止血、消腫等作用，外敷治創傷出血、癰腫、燙傷、疔瘡等；花美麗，栽培供觀賞。收斂止血，消腫生肌。主要用于止血，是一種名貴的止血藥物，用于咳血吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂；肺結核咳血，潰瘍病出血。
因此，為了滿足日益增大的藥用需求，種子收獲量小，種子繁殖出苗率極低，種子培育過程煩瑣，生長速度慢，同時保護白芨的野生資源，利用組培快繁技術，實現人工栽培是最好的解決方法。迄今為止，在國內外尚未見關于白芨組織培養快繁成功的報道。我們通過大量試驗，終于摸索出一套成熟的方法，成功實現了白芨的組培快繁，可以快速培育出大量幼苗， 為實現工業化人工栽培白芨提供可能。白芨的組培快繁技術方法的成功建立，可以為大規模人工栽培藥用植物白芨提供種苗，為現代科技農業提供了一種切實可行的開發項目。
發明內容
本發明的目的是提供白芨的快速繁殖方法，該方法非常適合工業化生產，配方效果佳，出芽率高，培養時間短，植株生長旺盛，可操作性強，應用價值高等優點。具有投入少， 產出高的特點。本發明所述白芨的快速繁殖方法，其具體操作步驟如下I)外植體的選取與滅菌選用白芨的假鱗莖上芽體作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；2)芽體的萌發將滅菌處理后的芽體接種在含NAA的LS+6-BA1. 2mg/L培養基上， pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后6_8天芽體的萌發，10天左右形成帶葉的小苗；3)叢生芽誘導和增殖培養將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養溫度23-27 °C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上；4)生根培養選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養基， pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株；5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土或富養土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上；6)后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行白芨栽培管理；若發生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑； 若發生根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土 ；若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。在一個具體實施方案中，步驟I中采用O. I %升汞進行消毒，消毒時間控制優選在 7-15分鐘。在一個具體實施方案中，步驟2中NAA的用量為O. 1-0. 3mg/L。在另一個具體實施方案中，步驟6中大田濕度控制在40-70 % ;溫度控制在 10-30。。。技術效果(I)利用白芨帶芽根莖段為外植體，使得外植體取材較容易，一年四季均可取材，而且數量多，采用根莖芽體做外植體，保證了遺傳穩定性，同時克服了組織培養中，愈傷組織在分化培養基上隨著芽的分化而逐漸停止生長，失去增殖能力的弱點，可防止傷組織繼代培養過程中，隨著培養代數的增加，分化出來的苗出現變異的現象。(2)本發明方法利用外植體建立，增殖生根同步化這一技術路線，僅需30天左右形成完整植株，4-6個月內事獲得大量完整植株，實現白芨的大規模工廠化育苗。(3)本發明方法獲得的試管苗在移載時所采用的基質利用沙土，方法簡單，而且大大降低了移載成本。本培養方法出芽快，增殖率高，方法簡單，生產成本低，可批量生產，應用價值高。(4)白芨的生產可以在人為控制條件下進行，不受季節、氣候條件與土壤等因素的制約，可排除病蟲害的侵襲和農藥殘留的影響，嚴格控制白芨的質量。增殖速度快，生產周期短，設備簡單，占地面積少，能節省人力、物力等，便于工廠
化生產。(5)使用本發明提供的組培快繁技術得到的白芨幼苗進行人工栽培，可以得到個體差異小，品質均一的白芨成品。(6)可以保存白芨的種質資源，同時有利于保護白芨野生資源，減少對自然資源的破壞。
具體實施例方式下面，本發明將用實施例進行進一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。實施例I :取材白芨帶芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的白芨鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒， 然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 2mg/L培養基上，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天芽體的萌發，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養基， pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行白芨栽培管理。若發生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。實施例2 取材白芨帶芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的白芨鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒， 然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. 3mg/L培養基上，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后7_8天芽體的萌發，12天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養選擇 LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L 作為生根培養基， pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上， 只需要25天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到富養土中，注意保水保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上。6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行白芨栽培管理。若發生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。 有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。實施例3 取材白芨帶芽莖段為外植體I、外植體的選取與滅菌采自湖南慈利的白芨鮮嫩芽莖段等幼嫩組織，作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒， 然后再經O. I %的升汞消毒10分鐘后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用。2、芽體的萌發將滅菌處理后的芽體接種在LS+6-BA1. 2mg/L+NAA0. lmg/L培養基上，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX ;接種后6_8天左右芽體的萌發，10天左右形成帶葉的小苗。3、叢生芽誘導和增殖培養將小苗切下轉接于LS+6-BA0. 5mg/L+IAA0. 4mg/L培養基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度 1000LX。30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。4、生根培養選擇LS+6-BA0. 5mg/L+NAA O. 5mg/L作為生根培養基，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到95%以上，只需要20天左右形成完整植株。5、試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈，移載到沙土中，注意保水保濕，移載I個月后，移載成活率達到85%以上。
6、后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行白芨栽培管理。若發生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑。 有時有根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土。若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。
權利要求
1.一種白芨的快速繁殖方法，其步驟包括.1)外植體的選取與滅菌選用白芨的假鱗莖上芽體作為培養材料，經洗潔精和自來水洗凈，置流水下沖洗10-30分鐘后，置于75%酒精中處理10-30秒，然后再經O. 1%的升汞消毒后用無菌水沖洗，切去外植體變色的部分后備用；.2)芽體的萌發將滅菌處理后的芽體接種在含NAA的LS+6-BA1.2mg/L培養基上，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照12小時，光照強度1000LX，接種后6_8天芽體的萌發， 10天左右形成帶葉的小苗；.3)叢生芽誘導和增殖培養將小苗切下轉接于LS+6-BA0.5mg/L+IAA0. 4mg/L培養基上，直至形成叢生芽，PH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX， 30天左右為一個生長周期，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上；.4)生根培養選擇LS+6-BA0.5mg/L+IAA0. 4mg/L+NAA O. 5mg/L作為生根培養基，pH值為5. 8，培養溫度23-27°C，每天光照16小時，光照強度1000LX，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株；.5)試管苗的移栽選取根系生長良好的試管苗，放入清水中把根部的瓊脂清洗干凈， 移載到沙土或富養土中，注意保水保溫保濕，移載I個月后，移載成活率達到90%以上；.6)后期管理4月份左右移植大田后，6-9月份用兩層遮陽網進行覆蓋，并采用滴管方式進行補水，進入11月份后用地膜進行保溫保水，到第二年3月份左右去除地膜，采用以上方式進行白芨栽培管理；若發生黑斑病，用70%甲基托布津濕性粉劑1000倍液噴灑；若發生根結線蟲病危害，用3%呋喃丹顆粒劑灌施盆土 ；若缺肥時在花后至8月中旬施I次磷肥。
2.權利要求I的方法，其中步驟I中采用O.I %升汞進行消毒，消毒時間控制優選在 7-15分鐘。
3.權利要求2的方法，其中步驟2中NAA的用量為O.1-0. 3mg/L。
4.權利要求3的方法，其中步驟6中大田濕度控制在40-70%;溫度控制在10-30°C。
全文摘要
本申請為一種白芨的快速繁殖方法，該方法是在MS培養基上培養白芨的假鱗莖段等組織，確切取帶1-2個芽的根莖段為外植體，消毒后，接種在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L培養基中培養，接種后6-8天左右芽體的萌發，10天左右形成帶葉的小苗，將小苗切下轉接于MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.4mg/L培養基上，以保持高速度遞增，增殖系數為5以上。選擇MS+6-BA1.5mg/L+IAA0.4mg/L+NAA0.5mg／L作為生根培養基，生根率達到90%以上，只需要25天左右形成完整植株。試管苗移載到沙土中，注意保水保濕，移載1個月后，移載成活率達到90%以上，建立了一套高頻穩定再生體系。本發明方法具有穩定好，操作簡便，繁殖速度快，生產成本低，達到產業化水平等優點。
文檔編號A01H4/00GK102599063SQ20121010008
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者向華 申請人:向華