專利名稱：一種海參微生態(tài)水質調節(jié)劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖技術及微生物技術領域，特別涉及一種復合微生態(tài)水質調節(jié)劑的制備。
背景技術：
近年來，刺參養(yǎng)殖已成為中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，但隨著刺參現(xiàn)代集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖迅速的發(fā)展，出現(xiàn)了一些嚴重問題，制約了其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，比如在養(yǎng)殖的過程中投喂大量高蛋白的餌料，很多未攝食的殘餌、糞便排泄物和生物死體在水體中，分解生成很多的有害物質，惡化了水質，病原菌大量繁殖，致使海參產(chǎn)生強烈的應激反應，出現(xiàn)了搖頭、身體收縮僵直、排臟、口腫、體表潰瘍等現(xiàn)象，最后大面積體壁腐爛而死。人們通常采用抗生素、化學合成藥物等防治刺參的疾病，但長期、大量使用抗生素不僅導致了刺參對病原微生物的易感性以及細菌耐藥性，引起過敏等不良反應，并且造成整個生態(tài)環(huán)境的污染，嚴重影響了節(jié)約減排和食品安全，阻礙了無公害刺參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。水產(chǎn)微生態(tài)制劑，是利用水產(chǎn)動物體內(nèi)或養(yǎng)殖水體中的有益微生物經(jīng)特殊加工工藝而形成的活菌制劑。水產(chǎn)微生態(tài)制劑具有氧化、氨化、硝化、反硝化、解磷、硫化及固氮等作用，可以使有害物質分解為小分子有機物(氨基酸、低級脂肪酸、單糖、環(huán)烴等)，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽、硫酸鹽等，有效地降低水中的C0D、氨氮、亞硝酸氮和硫化物的濃度，從而有效地改善水質。目前，應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的微生態(tài)水質調節(jié)劑，只限于一種或兩種益生菌凈化養(yǎng)殖水體，對養(yǎng)殖水體的凈化效果不明顯。海參的養(yǎng)殖水體中由于存有大量的殘餌和排泄物，會產(chǎn)生很多復雜的有害物質，如氨、硫化氫、有機酸等，需要多種益生菌對不同的有害物質達到同時一次凈化的效果。本發(fā)明本著來源于自然，回歸自然的原則，篩選與原宿主、原微生態(tài)系、原微生物種群相適應的菌種，選用從刺參養(yǎng)殖海水中篩選獲得的高效蛋白酶產(chǎn)生菌、亞硝化細菌和反硝化細菌，旨在經(jīng)過合理配伍研制一種專門針對凈化刺參養(yǎng)殖海水的微生態(tài)制劑，主要是利用復合微生物的高濃度、高活性以及微生物之間的各類共代謝作用來降解養(yǎng)殖水體中的毒性及有機物，即利用蛋白酶產(chǎn)生菌分泌的蛋白酶將養(yǎng)殖廢水中的可溶性蛋白分解成氨基酸，由亞硝化細菌和反硝化細菌的聯(lián)合作用，將氨氮轉化為無毒無害的氣態(tài)氮從水中逸出。本發(fā)明的復合微生態(tài)制劑可以在發(fā)酵合成的狀態(tài)下共存、共榮、共生、共養(yǎng)，使微生物群體朝著有益的方向發(fā)展成為一種具有活性的復合微生物。這些眾多的微生物在應用環(huán)境中相互聯(lián)合，在發(fā)生基質變遷的同時，構成新的生態(tài)學，重新建立生存關系，從而形成共同發(fā)揮作用的體系。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術中養(yǎng)殖水質污染嚴重、病害頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖海參死亡率高、海參體內(nèi)化學殘留超標，而發(fā)明一種海參養(yǎng)殖水體修復的微生態(tài)水質調節(jié)劑。針對海參的生理習性和養(yǎng)殖特點，應用現(xiàn)代生物技術，由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選的芽孢桿菌所組成的復、合益生菌，形成一個菌群共生增殖、功能齊全、結構穩(wěn)定的微生態(tài)水質調節(jié)劑。該微生態(tài)水質調節(jié)劑主要由芽孢桿菌、異養(yǎng)硝化細菌混合組成，由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離并篩選的枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) YB-1CGMCC No. 5116、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)YB-2CGMCCNo. 5117和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-1CGMCC No. 5115，以玉米粉和豆餅粉為主要培養(yǎng)料，以沸石和麥麩作為吸附載體，加工成固體粉劑。本發(fā)明中涉及的微生態(tài)制劑，于2011年08月05號送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(中國科學院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。本發(fā)明的主要方面是一種海參微生態(tài)水質調節(jié)劑的制備方法，包括以下操作步驟
①制備益生菌的種子液將枯草芽孢桿菌YB-1CGMCC No. 5116的菌懸液、蠟狀芽孢桿菌YB-2CGMCC No. 5117的菌懸液和彎曲芽孢桿菌XH-1CGMCC No. 5115的菌懸液，以I : I : I的菌數(shù)比例混合后，再按發(fā)酵液體積的3%接種，攪拌均勻，并于25-40°C發(fā)酵24-48h，制備益生菌種子液；其中，上述三種益生菌菌懸液的制備方法是本領域技術人員的常規(guī)技術，即將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長良好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) YB-1CGMCC No. 5116、臘狀芽抱桿菌(Bacillus cereus)YB-2CGMCC No. 5117和彎曲芽抱桿菌(Bacillus flexus)XH-lCGMCCNo. 5115，分別加入水后，分別制成一定濃度的菌懸液；②液態(tài)發(fā)酵向在密閉式發(fā)酵反應器中加入發(fā)酵液，向發(fā)酵液中按0. I 1%的體積比加入營養(yǎng)物質，再將步驟①制備的益生菌種子液，按3-5 %的體積比接種，進行發(fā)酵，壓力為0. 05 0. 25Mpa, 25 36°C發(fā)酵24 48h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；③噴霧干燥上述步驟②所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到吸附載體中；其中，步驟①和②所說的發(fā)酵液均由玉面粉豆餅粉水按(1.5 3) (0.7 1.3) 100的重量比組成，調pH7. 0 8. 0 ;步驟②所說的營養(yǎng)物質由麩皮豆餅粉水按(0. 5-2) (0. 5-3) 100的重量比組成；步驟③所述的吸附載體的組成為沸石粉和麩皮按I : I的體積比混合。在優(yōu)化條件下上述的制備方法中，步驟③所述的吸附載體中，沸石粉和麩皮均為50 100目。在優(yōu)化條件下上述的制備方法中，步驟①中菌懸液的菌體濃度均為IXlO8Cfu/ml o在優(yōu)化條件下上述的制備方法中，還包括以下操作步驟向步驟③制得的產(chǎn)物中加入吸附載體，混合并使菌含量的終濃度為IO7 IOltlCfVg ;其中，所述的吸附載體即上文所述的50 100目的沸石粉和麩皮按I : I的體積比混合制得。在優(yōu)化條件下上述的制備方法中，向步驟③制得的產(chǎn)物中加入吸附載體的重量比為I : I 1000。在優(yōu)化條件下上述的制備方法中，步驟③中發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到吸附載體的方法為發(fā)酵液與吸附載體重量比為I : I 4，干燥時間為6 36h，產(chǎn)物水份含量為4%。本發(fā)明的另外一方面在于，利用上述的方法制備的海參微生態(tài)水質調節(jié)劑產(chǎn)品。本發(fā)明的另外一方面在于，利用上述的海參微生態(tài)水質調節(jié)劑在海參養(yǎng)殖方面的應用。本發(fā)明的微生態(tài)水質調節(jié)劑受環(huán)境條件影響小，對海參的養(yǎng)殖水體具有非常顯著的凈化效果，在海參的育苗期和養(yǎng)成期定期潑灑該微生態(tài)水質調節(jié)劑，可以快速降解養(yǎng)殖水體中的有機污染物和氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質。 可以大幅降解水體中氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害離子含量，去除惡臭味，避免底質腐敗，有效抑制病原菌，減輕海參的應激，預防海參病害的發(fā)生，提高養(yǎng)殖海參的產(chǎn)量和質量。本發(fā)明的優(yōu)點是I.快速降解養(yǎng)殖水體中的有機污染物和氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質；2.迅速分解池底沉積的廢物、沉積物；3.避免水體水色突變和發(fā)黑發(fā)臭現(xiàn)象；4.適用于海參的育苗池和養(yǎng)成池，可以凈化“白濁水”、“鐵銹水”、“黑臭水”、“老綠水”等惡化水質；5.穩(wěn)定浮游植物的繁殖。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例中所用原料如無特殊說明，均由常規(guī)方法制備或由商業(yè)途徑獲得。LB瓊脂斜面培養(yǎng)基其組成每升中含蛋白腺5g,酵母骨lg，海水晶33g,憐酸聞鐵0. lg，pH7. 4-7. 6。固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中加入16g/L瓊脂粉，原料均購于匯合生物科技有限公司。玉米面粉，購于瑞祥生物科技發(fā)展有限公司，100-200目。豆餅粉，購于瑞祥生物科技發(fā)展有限公司，100-200目。麩皮，購于瑞祥生物科技發(fā)展有限公司，50-100目。沸石粉，購于浙江神石礦業(yè)有限公司，主要成分為斜發(fā)沸石，純度為55-70%，50-100 目。本發(fā)明實施例中涉及的微生態(tài)制劑包括由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選的芽孢桿菌包括枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) YB-1CGMCC No. 5116、臘狀芽抱桿菌(Bacilluscereus) YB-2CGMCC No. 5117 和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-1CGMCC No. 5115。將三株菌株于2011年08月05號送到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(中國科學院微生物研究所，郵編100101)，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。下面通過實例進一步詳細描述本發(fā)明。實施例II :制備益生菌的種子液。將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長良好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YB-lCGMCCNo. 5116、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)YB-2CGMCC No. 5117和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus) XH-lCGMCCNo. 5115，分別加入水后，分別制成菌體濃度均為IXlO8Cfu/ml的菌懸液，將上述三種菌懸液按照菌數(shù)I : I : I的比例混合，獲得混和菌懸液，將混和菌懸液以發(fā)酵液體積的3%接種于發(fā)酵液中，攪拌均勻l_2min，發(fā)酵條件是30°C，24h ;制備益生菌種子液。上述的發(fā)酵液由玉面粉豆餅粉水按1.5 0.7 100的重量比混合，調節(jié)pH7. 0-8. 0 ；2 :液態(tài)發(fā)酵。先將營養(yǎng)物質以1%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，再將步驟I制備的益生菌種子液，以5%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，在密閉式發(fā)酵反應器中進行發(fā)酵，壓力為0. 05-0. 25Mpa，發(fā)酵溫度36°C、發(fā)酵時間48h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；上述的營養(yǎng)物質由麩皮、豆餅粉和水按0.5 0. 5 100的重量比混合。3 :噴霧干燥。吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；上述步驟2所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到上述吸附載體中，發(fā)酵產(chǎn)物與吸附載體總重量比為I : 4，產(chǎn)物水份含量為4%，干燥時間為36h，制得微生態(tài)粉劑。4:稀釋。吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；將步驟3制備的微生態(tài)粉劑與吸附載體以重量比為I : 100混合，配制活菌含量在108cfu/g的復合微生態(tài)水質調節(jié)劑產(chǎn)品。實施例2I :制備益生菌的種子液。將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長良好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YB-lCGMCCNo. 5116、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)YB-2CGMCC No. 5117 和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-I CGMCC No. 5115，分別加入水后，分別制成菌體濃度均為I XlO8CfuAil的菌懸液，將上述三種菌懸液按照菌數(shù)I : I : I的比例混合，獲得混和菌懸液，將混和菌懸液以發(fā)酵液體積的3%接種于發(fā)酵液中，攪拌均勻l_2min，發(fā)酵條件是30°C，24h ;制備益生菌種子液。上述的發(fā)酵液由玉面粉豆餅粉水按3 : I : 100的重量比混合，調節(jié)pH7. 0-8. 0 ；2 :液態(tài)發(fā)酵。先將營養(yǎng)物質以0. 5%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，再將步驟I制備的益生菌種子液，以5%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，在密閉式發(fā)酵反應器中進行發(fā)酵，壓力為0. 05-0. 25Mpa，發(fā)酵溫度25°C、發(fā)酵時間48h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；上述的營養(yǎng)物質由麩皮、豆餅粉和水按2 I 100的重量比混合。3:噴霧干燥。 吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；上述步驟2所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到上述吸附載體中，發(fā)酵產(chǎn)物與吸附載體總重量比為I : 4，產(chǎn)物水份含量為4%，干燥時間為24h，制得微生態(tài)粉劑。
4 :稀釋。吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；將步驟3制備的微生態(tài)粉劑與吸附載體以重量比為I : 1000混合，配制活菌含量在107cfu/g的復合微生態(tài)水質調節(jié)劑產(chǎn)品。實施例3 I :制備益生菌的種子液。將在LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上生長良好的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YB-lCGMCCNo. 5116、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)YB-2CGMCC No. 5117 和彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)XH-I CGMCC No. 5115，分別加入水后，分別制成菌體濃度均為I XlO8CfuAil的菌懸液，將上述三種菌懸液按照菌數(shù)I : I : I的比例混合，獲得混和菌懸液，將混和菌懸液以發(fā)酵液體積的3%接種于發(fā)酵液中，攪拌均勻l_2min，發(fā)酵條件是30°C，24h ;制備益生菌種子液。上述的發(fā)酵液由玉面粉豆餅粉水按3 : I : 100的重量比混合，調節(jié)pH7. 0-8. 0 ；2:液態(tài)發(fā)酵。先將營養(yǎng)物質以1%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，再將步驟I制備的益生菌種子液，以5%的體積比接種于上述發(fā)酵液中，在密閉式發(fā)酵反應器中進行發(fā)酵，壓力為
0.05-0. 25Mpa，發(fā)酵溫度36°C、發(fā)酵時間48h，制得發(fā)酵產(chǎn)物；上述的營養(yǎng)物質由麩皮、豆餅粉和水按I : 3 100的重量比混合。3 :噴霧干燥。吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；上述步驟2所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到上述吸附載體中，發(fā)酵產(chǎn)物與吸附載體總重量比為I : 2，產(chǎn)物水份含量為4%，干燥時間為36h，制得微生態(tài)粉劑。4 :稀釋。吸附載體由50-100目的沸石粉和50-100目的麩皮按體積比為I : I混合配制；將步驟3制備的微生態(tài)粉劑與吸附載體以重量比為I : 1-10混合，配制活菌含量在109cfu/g的復合微生態(tài)水質調節(jié)劑產(chǎn)品。實施例4實際應用效果 選取六處條件相似的海參育成圈，平均水深2m，參苗規(guī)格30-50頭/500克，密度在5-10頭/平方米。1、2、3號圈為對照組(未潑灑微生態(tài)水質調節(jié)劑)，4、5、6號圈為實驗組(潑灑微生態(tài)水質調節(jié)劑)；實驗組除了定期潑灑實施例1、2、3所述的微生態(tài)水質調節(jié)劑之外，飼喂
和管理方法與對照組一樣。實驗周期為2010. 05-2010. 07的兩個月，實驗組每隔3天潑灑I次，潑灑量為5g/m3。實驗期間，定期檢測水質，觀察海參攝食情況，每隔15天下水摸探，測量海參。鹽度為37-38%。，水溫為18-22°C,pH為7. 9-8. 4，溶解氧為3. 5-5. 5mg/L。實驗池的透明度為25. 0-44. Ocm0實驗結果如下
表I復合微生態(tài)水質調節(jié)劑的水質指標比較結果(30天)
權利要求
1.一種海參微生態(tài)水質調節(jié)劑的制備方法，包括以下步驟 ①制備益生菌的種子液 將枯草芽孢桿菌YB-lCGMCCNo. 5116的菌懸液、蠟狀芽孢桿菌YB_2CGMCCNo. 5117的菌懸液和彎曲芽孢桿菌乂11-106110^0.5115的菌懸液，以1 : I : I的菌數(shù)比例混合后，再按發(fā)酵液體積的3%接種，攪拌均勻，并于25-40°C發(fā)酵24-48h，制備益生菌種子液； ②液態(tài)發(fā)酵 向在密閉式發(fā)酵反應器中加入發(fā)酵液，向發(fā)酵液中按0. I 1%的體積比加入營養(yǎng)物質，再將步驟①制備的益生菌種子液，按3-5%的體積比接種，進行發(fā)酵，壓力為0. 05 0. 25Mpa，25 36°C發(fā)酵24 48h，制得發(fā)酵產(chǎn)物； ③噴霧干燥 上述步驟②所得的發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到吸附載體中； 其中， 步驟①和②所說的發(fā)酵液均由玉面粉豆餅粉水按I. 5 3 0. 7 I. 3 100的重量比組成，調pH7. 0 8. 0 ; 步驟②所說的營養(yǎng)物質由麩皮豆餅粉水按0. 5-2 0. 5-3 100的重量比組成； 步驟③所述的吸附載體的組成為沸石粉和麩皮按I : I的體積比混合。
2.根據(jù)權利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的吸附載體中，沸石粉和麩皮均為50 100目。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟①中菌懸液的菌體濃度均為lX108cfu/ml。
4.根據(jù)權利要求1、2或3中任一項所述的制備方法，其特征在于還包括向步驟③制得的產(chǎn)物中加入吸附載體，混合并使菌含量的終濃度為IO7 101(lCfu/g。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，向步驟③制得的產(chǎn)物中加入吸附載體的重量比為I : I 1000。
6.根據(jù)權利要求1、2或5中任一項所述的制備方法，其特征在于，步驟③中發(fā)酵產(chǎn)物噴霧干燥到吸附載體的方法為發(fā)酵液與吸附載體重量比為I : I 4，干燥時間為6 36h，產(chǎn)物水份含量為4%。
7.如權利要求I所述的方法制備的海參微生態(tài)水質調節(jié)劑。
8.如權利要求7所述的海參微生態(tài)水質調節(jié)劑在海參養(yǎng)殖方面的應用。
全文摘要
一種適于海參養(yǎng)殖水體修復的微生態(tài)水質調節(jié)劑及其制備方法，屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術及微生物技術領域。本發(fā)明的針對海參的生理習性和養(yǎng)殖特點，應用現(xiàn)代生物技術，由海參養(yǎng)殖環(huán)境中分離篩選的彎曲芽孢桿菌CGMCC No.5115、枯草芽孢桿菌CGMCC No.5116和蠟狀芽孢桿菌CGMCC No.5117所組成，以玉米粉和豆餅粉為主要培養(yǎng)料，25-40℃發(fā)酵24-48h，再以沸石和麥麩作為吸附載體，加工制得微生態(tài)水質調節(jié)劑。本產(chǎn)品受環(huán)境條件影響小，對海參的養(yǎng)殖水體具有非常顯著的凈化效果，可以大幅降低氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質的含量，去除惡臭味，有效抑制病原菌，預防海參病害的發(fā)生，提高養(yǎng)殖海參的產(chǎn)量和質量。
文檔編號A01K61/00GK102616941SQ20121008215
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權日2012年3月26日
發(fā)明者徐永平, 李建光, 汪將, 蒲紅宇, 車鑒, 金禮吉 申請人:大連理工大學