專利名稱：一種棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物領(lǐng)域組織培養(yǎng)的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具體涉及棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
棉花是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物，彩色棉的纖維具有天然色彩，用它進(jìn)行紡織避免了化工染料對(duì)人體的毒害和對(duì)棉纖維自身優(yōu)良品質(zhì)的破壞，隨著人們生活水平的日益提高和紡織工業(yè)的飛速發(fā)展使其倍受青睞。但彩色棉由于受到產(chǎn)量低、產(chǎn)業(yè)化加工規(guī)模有限等因素的限制，未能大面積示范推廣，利用常規(guī)育種手段進(jìn)行品質(zhì)改良具有難度，在一定程度上影響了彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉育種的突破極大地促進(jìn)了世界棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同時(shí)使轉(zhuǎn)基因育種作為傳統(tǒng)育種的重要補(bǔ)充手段得到育種家的公認(rèn)，拓展建立不同彩色棉品種類型的再生體系，是利用轉(zhuǎn)基因手段改良彩色棉品種和品質(zhì)的關(guān)鍵所在，對(duì)彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要研究?jī)r(jià)值。利用遺傳工程技術(shù)改良棉花品種能夠提高棉花的種植效益，雖然棉花生物技術(shù)育種獲得了突破性進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉成功應(yīng)用于棉花生產(chǎn)，但仍存在許多不足，棉花育種研究仍然存在著很多障礙，其中植株再生的高效體系是棉花轉(zhuǎn)基因育種的先決條件，獲得胚性愈傷組織是植株再生的前提，也是能否建立再生體系的關(guān)鍵，如何促進(jìn)胚性愈傷組織的分化、體細(xì)胞胚成熟、提高再生率一直是眾多研究者所要突破的難題。棉花遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的復(fù)雜性(難重復(fù)、轉(zhuǎn)化率低)和轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀的變異等，這些問(wèn)題都是棉花生物技術(shù)育種研究的瓶頸，目前獲得的再生體系具有很強(qiáng)的基因依賴性。我們首次開(kāi)展隴棕棉系列品種的再生研究，通過(guò)對(duì)棕色棉組織培養(yǎng)再生各個(gè)階段關(guān)鍵因素的研究，獲得了棕色棉胚性愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中的各種影響因素的最適培養(yǎng)條件，為彩色棉轉(zhuǎn)基因育種提供了技術(shù)支撐。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，克服了棕色棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生的困難，提供了一種棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，包括有以下步驟I)棕色棉種子人工脫殼后，再經(jīng)過(guò)消毒處理，得到無(wú)菌棕色棉種子，再將無(wú)菌棕色棉種子放入搖床中遮光懸浮暗培養(yǎng)24-36小時(shí)，在胚根生長(zhǎng)至O. 8-1. 2cm時(shí)，接種于1/2所有元素減半的MSB培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，得到2-4cm長(zhǎng)的無(wú)菌苗下胚軸；2)將步驟I)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5_8mm小段，并置于棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織；3)將步驟2)得到的初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)接至棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)2次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到增殖后棕色棉愈傷組織；
4)將步驟3)得到的增殖后棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)入棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2-3次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到胚性愈傷組織；5)將步驟4)得到的胚性愈傷組織置于棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。上述棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟I)中，消毒處理的過(guò)程為棕色棉種子先以O(shè). 1%的貢溶液滅菌8-12分鐘，再以無(wú)菌水沖洗5-8遍,最后加無(wú)菌水在搖床懸浮培養(yǎng)24-36小時(shí)至種子胚根伸長(zhǎng)；搖床的溫度為27_29°C，速度為120rpm。上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟2)中，棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 1.9-3.8g/L KNO3>O. 75g/L MgCl2，同時(shí)附加有 O. 3-0. 8mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 5-1. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟3)中，棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 1-0. 5mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 4_lmg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟4)中，棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 05-0. 2mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。上述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，所述步驟5)中，棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MSB培養(yǎng)基，其中NH4NO3濃度減半，為O. 825g/L。本發(fā)明提供的誘導(dǎo)棕色棉胚性愈傷組織的方法，從外植體的培養(yǎng)到愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷組織增殖分化，調(diào)節(jié)和篩選質(zhì)地疏松、無(wú)硬化、顏色淺綠、灰綠到黃綠的愈傷組織， 對(duì)其增殖及分化過(guò)程的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終研究得到胚性愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間為5-8 月，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100 %，胚性愈傷組織分化率達(dá)15 % -20 %。外植體培養(yǎng)是建立再生體系的第一步，種子脫殼可有效提高種子萌發(fā)率，降低污染率；搖床培養(yǎng)可增加種子發(fā)芽率，縮短發(fā)芽時(shí)間，同時(shí)可解決直接浸泡時(shí)供氧不足和種子間的相互擠壓造成的胚根傷殘。無(wú)菌苗的生長(zhǎng)采用了暗培養(yǎng)處理，幼嫩的下胚軸使誘導(dǎo)出的愈傷組織狀態(tài)較好， 有利于分化。2，4-D在誘導(dǎo)愈傷組織中是比較有效的一種外源激素，它啟動(dòng)細(xì)胞分裂速度快，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織頻率高、質(zhì)量好，在棉花組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化中被廣泛應(yīng)用，但2，4-D 也會(huì)導(dǎo)致愈傷組織褐化，不利于后期胚性愈傷組織的產(chǎn)生。因此，本研究在愈傷組織誘導(dǎo)期直接使用較高濃度的KT和IBA。在后期愈傷組織增殖繼代培養(yǎng)中采取降低激素濃度的方法，以提高胚性愈傷的分化率。愈傷組織分化后期去掉外源激素更加有利于胚性愈傷分化。 在愈傷誘導(dǎo)的前期添加1.9-3.8g/L KNO3,0. 75g/L MgCl2有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和胚性愈傷組織的形成。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明充分考慮了愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中生長(zhǎng)素和分裂素的影響，通過(guò)最佳外植體的培養(yǎng)，外源激素的誘導(dǎo)，愈傷組織向胚性愈傷生長(zhǎng)及分化過(guò)程轉(zhuǎn)化，最終獲得體細(xì)胞胚胎及再生植株。在胚性愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中對(duì)激素種類和濃度，凝固劑，氮源的使用量進(jìn)行摸索， 獲得了一個(gè)成熟的適應(yīng)于棕色棉胚性愈傷組織生成的方法。該方法耗時(shí)短，誘導(dǎo)率高，拓展了棉花可再生的基因型，該方法適應(yīng)于棕色棉品種，對(duì)彩棉轉(zhuǎn)基因育種的應(yīng)用具有技術(shù)支撐作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案材料中上述材料中提及的的MSB培養(yǎng)基，是利用MS培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)兀素以及B5培養(yǎng)基的有機(jī)兀素組合的一種培養(yǎng)基。其主要成分及用量如表I所不表I
組成成分濃度(mg/L)MS大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl2.2H20440MgS04+7H20370KH2POi1170MS微量元素KT0.83H3BO36.2MnS〇4.4H2022.3ZnSO4-TH2O8.6Na2Mn04.2H2〇0.25CuS04.5H200.025CoC12.6H200.025MS鐵鹽FeSO4-7H2027.8Na9-EDTA-2H9037.3B5有機(jī)元素肌醇100煙酸I鹽酸吡哆醇(維生素B6)I鹽酸硫胺素(維牛.素BI)10以上試劑均為分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。KT為N6-異戊烯腺嘌呤；IBA為吲哚丁酸，均為分析純?cè)噭?，?gòu)自Sigma公司。Gelrite為植物凝膠,購(gòu)自Sigma公司。繼代培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的專業(yè)術(shù)語(yǔ)，意思就是由于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的減少，培養(yǎng)物分泌產(chǎn)物積累，導(dǎo)致愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，影響愈傷組織其細(xì)胞分化很難保持一個(gè)旺盛分裂、均一的群體狀態(tài)，需要在一定時(shí)間段把愈傷組織轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，其目的就是使培養(yǎng)的愈傷組織保持旺盛的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)施例I :(I)供試材料隴棕棉品系 BC05、9501B、BC06-10。(2)外植體培養(yǎng)棕色棉種子先人工脫殼，消毒后進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，胚根長(zhǎng)出后接種于1/2MSB培養(yǎng)基暗培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為3-5天，培養(yǎng)溫度為27-29°C。(3)將獲得的無(wú)菌苗下胚軸切成5-8mm小段，平放于添加I. 9-3. 8g/L KNO3,0. 75g/ L MgCl2,同時(shí)附加 O. 3-0. 8mg/L KT+0. 5-1. 5mg/L IBA 的 MSB 培養(yǎng)基。(4)30天后，棕色棉下胚軸全部成功誘導(dǎo)出愈傷組織，顏色呈黃綠色或淡黃色， 狀態(tài)疏松。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至添加I. 9-3. 8g/L KNO3，同時(shí)附加O. 1-0. 5mg/L KT+0. 4-1. Omg/LIBA的MSB培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2次。(5)挑選生長(zhǎng)旺盛，狀態(tài)疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)入添加I. 9-3. 8g/L KNO3，同時(shí)附加 O. 05-0. 2mg/L KT+0. 1-0. 5mg/L IBA的MSB培養(yǎng)基，25天繼代培養(yǎng)I次，繼代培養(yǎng)2_3次后， 從愈傷組織底部或側(cè)邊緣誘導(dǎo)產(chǎn)生淡黃色松散顆粒狀的胚性愈傷組織，占總接種愈傷組織的 15% -20%。(6)將挑選出的胚性愈傷組織放置在降低NH4NO3濃度，同時(shí)去掉激素的培養(yǎng)基中， 即接種在無(wú)激素的NH4NO3濃度降低的改良MSB培養(yǎng)基上，15天繼代培養(yǎng)I次，胚性愈傷組織增殖倍數(shù)可達(dá)2倍。最后應(yīng)說(shuō)明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行優(yōu)化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，包括有以下步驟1)棕色棉種子人工脫殼后，再經(jīng)過(guò)消毒處理，得到無(wú)菌棕色棉種子，再將無(wú)菌棕色棉種子加適量無(wú)菌水放入搖床中遮光懸浮暗培養(yǎng)24-36小時(shí)，在胚根生長(zhǎng)至O. 8-1. 2cm時(shí)，接種于1/2所有元素減半的MSB培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)3-5天，得到2-4cm長(zhǎng)的無(wú)菌苗下胚軸；2)將步驟I)得到的無(wú)菌苗下胚軸在無(wú)菌條件下切為5-8_小段，并置于棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)30天，得到初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織；3)將步驟2)得到的初級(jí)培養(yǎng)棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)接至棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)2次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到增殖后棕色棉愈傷組織；4)將步驟3)得到的增殖后棕色棉愈傷組織轉(zhuǎn)入棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng) 2-3次，繼代培養(yǎng)周期為25天，得到胚性愈傷組織；5)將步驟4)得到的胚性愈傷組織置于棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟I)中，消毒處理的過(guò)程為棕色棉種子先以O(shè). 1%的升汞溶液滅菌8-12分鐘，再以無(wú)菌水沖洗 5-8遍,最后加無(wú)菌水在搖床懸浮培養(yǎng)24-36小時(shí)至種子胚根伸長(zhǎng)；搖床的溫度為27-29°C, 速度為120rpm。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟2)中，棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 I. 9-3. 8g/L KN03、0. 75g/ L MgCl2,同時(shí)附加有O. 3-0. 8mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 5-1. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟3)中，棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 1-0. 5mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 4-lmg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟4)中，棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基為按照以下比例加入了 O. 05-0. 2mg/L N6-異戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 5mg/L吲哚丁酸的MSB培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟5)中，棕色棉胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MSB培養(yǎng)基，其中NH4NO3濃度減半，為O.825g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，包括有以下步驟棕色棉種子消毒后剝?nèi)シN皮進(jìn)行培養(yǎng)，得到無(wú)菌苗下胚軸；無(wú)菌苗下胚軸置于棕色棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)接至棕色棉愈傷組織增殖培養(yǎng)基并繼代培養(yǎng)；轉(zhuǎn)入棕色棉愈傷組織分化培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)得到胚性愈傷組織；再進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明提供的棕色棉胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，耗時(shí)短，誘導(dǎo)率高，拓展了可再生棉花的基因型，適應(yīng)于彩棉的棕色棉品種，對(duì)該類型的彩棉轉(zhuǎn)基因研究具有技術(shù)支撐作用。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102577979SQ20121007118
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者劉新星, 厚毅清, 張敏敏, 李忠旺, 王紅梅, 羅俊杰, 裴懷弟, 陳子萱, 陳玉梁 申請(qǐng)人:甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所