專利名稱：免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法
技術領域：
本發明涉及一種抗菌素的制備方法，特別涉及一種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法。
背景技術：
抗菌妝(antibacterialpeptides)又稱妝抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物(antimicrobialpeptide),是生物免疫系統產生的一類抵抗外界生物感染源的活性多肽，在昆蟲、植物、動物及人體內廣泛存在。它除有非特異性的抗細菌、真菌、病毒、抗感染、抗疾病的作用外，還有抗細胞變異、抗腫瘤細胞的作用，且不損害人體正常細胞，尤其對多重耐藥菌株仍有效。抗菌肽對革蘭氏陽性和陰性細菌約40余種、綠膿桿菌和副傷寒菌等耐藥性菌株均有較強的殺滅作用。抗菌肽是當今生物藥物研發的重點和熱點。已有學者對由青枯病病原菌引起的番茄和辣椒青枯病(Bacterial Wilt)、由枯萎鐮刀菌引起的香蕉枯萎病(Fusarium wilt)等世界性細菌毀滅性土傳病害進行了研究、試驗，證明利用抗菌肽，通過拌土、施灌、植株浸根、拌種等方法可對以上病害進行有效地防治，尤其在我國兩廣和福建等溫暖潮濕的環境中，發病率可減少80%以上。通過生物抗菌肽的廣泛應用，可有效地防止、減輕農業病蟲害，減少農藥的施用量，降低農業生產投入，確保農產品食用安全，實現農業增產增收，從而起到事半功倍、綠色環保的作用。相關研究證明家蠶具有超強的免疫蛋白合成能力，一條蠶，在不到一個月的生長期中，利用22 25g的桑葉可合成并分泌O. 5^1. 5g的絲蛋白。現已有家蠶抗菌肽的相關研究，如中國專利ZL200910116463. 3公開了一種誘導家蠶產生抗菌肽的方法，所述該方法是采用病毒或細菌注射，或者可以采用使家蠶饑餓的方法；采用病毒或細菌注射時，給家蠶注射微量的細菌或病毒，采用使家蠶饑餓的方法時，對家蠶不喂桑葉，讓其饑餓48小時，再正常飼養24小時，該專利所述誘導方法簡單易行，能有效誘導出較多的抗菌肽，使抗菌肽提取效率大為提高；中國專利ZL200910193620. O則公開了一種家蠶抗菌肽BmcecE及其cDNA序列與應用，該發明的家蠶抗菌肽對革蘭氏陽性菌(蘇云金芽孢桿菌)、以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌)均具有抗菌活性、抗菌譜廣，家蠶抗菌肽BmcecE可用于人、畜、禽的藥物研發、預防和治療由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌感染引起人、畜、禽的致病，還可以用于生物產品添加劑的制備，防止由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌引起的生物產品的腐敗變質。但目前未見采用免疫誘導生物技術，利用五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽、在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，進而通過固相或液相生物技術合成、擴增，制備用于農業抗菌生產的廣譜抗菌素。
發明內容
本發明的目的是提供一種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法。
為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下一種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，以天然五齡蠶為原材料，通過天然五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽，在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，以生物高活性劑對絲蛋白抗菌基因進行調控，以固相或液相生物技術合成、擴增，制得廣譜抗菌素，所述的調控及固相或液相生物技術合成、擴增的具體步驟為在天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白或天然五齡蠶后部絲腺合成絲素蛋白時，進行免疫誘導，然后在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體經冷凍干燥至水分含量為709Γ75%或將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎后，投入50kg反應釜中，并加 入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。本發明所述的免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法為下列方法中的一種
(1)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為70°/Γ75%，然后將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；
(2)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；
(3)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量70°/Γ75%，將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素；
(4)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性劑，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。所述免疫誘導方法為用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處或接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，接種后3 5日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期。所述生物高活性劑為生物分裂素，為湛江師范學院自主知識產權研究成果生產。所述凍干的條件為2-4小時內，將溫度由常溫降到預凍溫度-20°C，保持-20°C I. 5-3小時，再由-20°C升溫至_5'8°C，維持2 4小時，然后用真空泵抽干。所述廣譜抗菌素為用于農業抗菌生產的生物有機產品或抗菌生物添加劑。所述廣譜抗菌素為固體抗菌有機肥料或液體抗菌有機肥料。本發明相對于現有技術的有益效果是本發明所述免疫誘導生物技術合成制備廣譜抗菌素的方法，其生物技術合成路線簡便易學，生產成本低廉，產率可控度高，防病害能力高達95%，且便于產業化生產；采用本發明方法制備得到的在農用時拌土，栽前浸根，對革蘭氏陽性菌(蘇云金芽孢桿菌)、以及革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌)或是由蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、靈菌敗血病菌或青枯菌、枯草桿菌、青枯病等病原菌、枯萎鐮刀菌引起的感染，具有較強的抗菌作用及高效、廣譜的抗菌優勢。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發明，并不限制本發明的范圍。實施例I 采用本發明所述方法，按下列步驟制備一種用于農業抗菌生產的廣譜抗菌素
(1)抗體菌種枯草桿菌；生物高活性劑來源于湛江師范學院自主知識產權研究成果生產的生物分裂素；
(2)制備步驟
①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處，免疫誘導，接種后3日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為70%，然后將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物分裂素，在常溫下發酵7天；
③發酵結束，采用下列凍干條件將發酵后的產物凍干2小時常溫降到預凍溫度_20°C，保持-20°C 2. 5小時，再由-20°C升溫至_6°C，維持2小時，然后用真空泵抽干；
④凍干后即制得用于農業抗菌生產有機生物農藥。實施例2 采用本發明所述方法，按下列步驟制備一種用于農業抗菌生產的廣譜抗菌素
(1)抗體菌種枯草桿菌；生物高活性劑來源于湛江師范學院自主知識產權研究成果生產的生物分裂素；
(2)制備步驟
①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處，免疫誘導，接種后4日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物分裂素，在常溫下發酵6天；
③發酵結束，采用下列凍干條件將發酵后的產物凍干2.5小時常溫降到預凍溫度-20°C，保持_20°C I. 5小時，再由-20°C升溫至_7°C，維持2. 5小時，然后用真空泵抽干；
④凍干后即制得液態的用于農業抗菌生產的抗菌生物添加劑。實施例3 采用本發明所述方法，按下列步驟制備一種用于農業抗菌生產的廣譜抗菌素
(O目標抗體菌種枯草桿菌；生物高活性劑來源于湛江師范學院自主知識產權研究成果生產的生物分裂素；
(2)制備步驟
①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，免疫誘導，接種后5日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為75%，然后將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物分裂素，在常溫下發酵8天； ③發酵結束，采用下列凍干條件將發酵后的產物凍干4小時常溫降到預凍溫度_20°C，保持_20°C 2小時，再由-20°C升溫至_5°C，維持4小時，然后用真空泵抽干；
④凍干后產品即為固體抗菌有機肥料成品，分裝后用于農業抗菌生產。實施例4 采用本發明所述方法，按下列步驟制備一種用于農業抗菌生產的廣譜抗菌素
(1)抗體菌種枯草桿菌；生物高活性劑來源于湛江師范學院自主知識產權研究成果生產的生物分裂素；
(2)制備步驟
①天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，免疫誘導，接種后3日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期；
②在免疫高峰期，將處于免疫高峰期的天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物分裂素，在常溫下發酵7天；
③發酵結束，采用下列凍干條件將發酵后的產物凍干3小時常溫降到預凍溫度_20°C，保持_20°C 3小時，再由-20°C升溫至_8°C，維持3小時，然后用真空泵抽干；
④凍干后產品即為液體抗菌有機肥料成品，分裝后用于農業抗菌生產。
權利要求
1.ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于該方法是以天然五齡蠶為原材料，通過天然五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽，在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，以生物高活性劑對絲蛋白抗菌基因進行調控，以固相或液相生物技術合成、擴增，制得廣譜抗菌素，所述的調控及固相或液相生物技術合成、擴增的具體步驟為在天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白或天然五齡蠶后部絲腺合成絲素蛋白時，進行免疫誘導，然后在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體經冷凍干燥至水分含量為709Γ75%或將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎后，投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性剤，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。
2.一種如權利要求I所述的免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于為下列方法中的ー種 (1)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量為70°/Γ75%，然后將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性剤，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素； (2)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體中部絲腺1/2處合成絲膠蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性剤，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素； (3)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體冷凍干燥至水分含量70°/Γ75%，將經冷凍干燥的天然五齡蠶蠶體投入50kg反應釜中，并加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性剤，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素； (4)天然五齡蠶生長到第三天，在天然五齡蠶體尾部絲腺處合成絲素蛋白時，用接種器接種枯草桿菌，進行免疫誘導，在免疫高峰期，將天然五齡蠶蠶體直接碾磨粉碎并將粉碎后得到的液體投入50kg反應釜中，加入占天然五齡蠶蠶體質量1/1000的生物高活性剤，在常溫下發酵6-8天，凍干后，即得到廣譜抗菌素。
3.根據權利要求I或2所述的ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于所述免疫誘導方法為用接種器將枯草桿菌接種到天然五齡蠶蠶體中部絲腺1/2處或接種到天然五齡蠶蠶體尾部絲腺處，接種后3、日天然五齡蠶蠶體達到免疫高峰期。
4.根據權利要求I或2所述的ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于所述生物高活性劑為生物分裂素。
5.根據權利要求I或2所述的ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在干所述凍干的條件為2-4小時內，將溫度由常溫降到預凍溫度-20°C，保持-20°C I. 5-3小時，再由-20°C升溫至_5'8°C，維持2 4小時，然后用真空泵抽干。
6.根據權利要求I或2所述的ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于所述廣譜抗菌素為用于農業抗菌生產的生物有機產品或抗菌生物添加剤。
7.根據權利要求I或2所述的ー種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法，其特征在于所述廣譜抗菌素為固體抗菌有機肥料或液體抗菌有機肥料。
全文摘要
本發明公開了一種免疫誘導生物技術制備廣譜抗菌素的方法。本發明免疫誘導生物技術合成制備廣譜抗菌素的方法利用了家蠶具有超強的免疫蛋白合成能力，通過天然五齡蠶中部絲腺高量合成絲膠蛋白抗菌肽，在后部絲腺合成絲素蛋白抗菌肽，以生物高活性劑對絲蛋白基因進行調控，以固相或液相生物技術合成、擴增，制得廣譜抗菌素。本發明方法生物技術合成路線簡便易學，生產成本低廉，產率可控度高，防病害能力高達80%~95%以上，且成果易轉化、便于產業化生產；采用本發明方法制備得到的抗菌肽在農用時拌土，栽前浸根，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌或枯草桿菌、青枯病等病原菌、枯萎鐮刀菌引起的感染，具有較強的抗菌作用及高效、廣譜的抗菌優勢。
文檔編號C05G3/00GK102613249SQ201210039809
公開日2012年8月1日 申請日期2012年2月22日 優先權日2012年2月22日
發明者李典, 羅富英 申請人:湛江師范學院