專利名稱：一種三角帆蚌人工催產及授精的方法
技術領域：
本發明屬于貝類人工繁殖技術領域，本發明具體公開了一種三角帆蛘人工催產及授精的方法。
背景技術：
三角帆蛘Qfyriopsis cumuingii )隸屬于軟體動物門，雙殼綱，真瓣鰓目，蛘科，為我國特有種，是我國淡水育珠的優質品種之一。自二十世紀80年代起，三角帆蛘取代褶紋
(Cristaria plicata )^ W^l{Anodonta woodiana woodiana )等品禾中在我國淡水育珠產業上廣泛使用，這使得我國淡水珍珠產量一舉超越了日本，成為世界淡水珍珠第一生產大國和出口大國，并一直持續至今。中國珠寶協會的統計數據表明我國淡水珍珠年產量約占世界珍珠產量的90%。目前，世界70%以上的淡水珍珠由三角帆蛘培育而成。三角帆蛘在我國淡水珍珠養殖業中，乃至世界珍珠養殖業中的地位舉足輕重。二十世紀70年代末，我國就突破了三角帆蛘人工繁殖技術。在生產上，通常采用大型池塘培育三角帆蛘親本，讓其自然受精，再從中挑選外鰓絲懷有成熟鉤介幼蟲的雌蛘進行人工采苗。但由于親本性腺發育不同步，需要從大量的親本中、多次挑選成熟雌蛘用于人工繁育，不僅工作量大，而且效率低。國內外對三角帆蛘的受精方式和過程尚不十分清楚，傳統親本培育方式無法實現三角帆蛘的人工受精，這限制了一些基礎應用研究，如多倍體育種、家系選育等研究的開展。貝類的多倍體育種研究為海洋貝類養殖業的繁榮和發展作出了巨大貢獻，尤其是三倍體貝類養殖取得了顯著的經濟效益。美國通過人工多倍體誘導成功獲得了三倍體牡蠣，并在生產上有廣泛的應用，目前50%以上的養殖牡蠣是三倍體，養殖效益顯著增加。理論上由于三倍體貝類性腺不發育或發育不良，其能量大部分用于生長，生長速度、個體規格顯著高于二倍體貝類。眾所周知，培育珍珠的大小很大程度上依賴于有大規格的育珠蛘作為載體。如果在淡水珍珠養殖生產上能使用三倍體三角帆蛘，我國的淡水珍珠養殖業將再次出現質的飛躍。而開展多倍體育種研究的首要條件是實現物種的人工授精，進而在受精卵的不同發育時期使用誘導劑，如6-DMAP、細胞松弛素等進行人工倍性誘導。由于海水貝類行體外受精，通常采用物理的(如溫度、陰干、流水刺激)、化學的方法(如氨水)誘導或解剖分別獲得成熟的精子和卵子，混合后獲得受精卵，開展多倍體育種研究比較容易實現，但對實驗動物造成嚴重的傷害甚至死亡。此外，家系選育是遺傳育種研究中重要而有效的技術方法之一，由于三角帆蛘親本個體發育不同步、不能同時受精的問題，建立同一批的家系難度較大。與海水貝類不同，三角帆蛘具有蛘科物種典型的繁殖特性雄蛘的精子和雌蛘的卵子需要在雌蛘的外鰓絲上受精發育，其受精過程更為復雜。由于基礎繁殖生物學研究薄弱，目前尚無法人工控制其受精過程。實現人工授精是三角帆蛘全人工繁殖的關鍵技術瓶頸之一，也是開展三角帆蛘多倍體育種、家系選育研究的基本條件。因此，研究三角帆蛘人工授精的方法具有重要理論價值和一定的應用前景。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中存在的不足，提供一種避免了對實驗動物的傷害，突破了三角帆蛘的全人工繁育中關鍵技術瓶頸，為開展三角帆蛘多倍體育種、家系選育研究提供基本條件的一種三角帆蛘人工催產及授精的方法。按照本發明提供的技術方案，所述三角帆蛘人工催產及授精的方法包括以下步驟
a、選取貝殼完整無損、噴水有力、健康的三角帆蛘4飛齡親本并鑒別其性別；具體通過比較內外鰓絲的間隔寬度鑒別雌雄外鰓絲寬度致密，且顯著小于內鰓絲寬度者為雌蛘， 內外鰓絲間隔寬度一致者為雄蛘；
b、在鑒別完雌雄性別的親本的貝殼表面進行標記，并記錄標記后親本個體相關信息； C、將標記后的親本按照雌雄性別隔離進行培育池放養培育，放養密度均為5 10只/平
方米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作為水源保持培育池內為流動水， 培育池內流動水的流速控制在0. 5^3米/分鐘；
d、親本隔離培育至5月中旬，當近5日平均水溫達1纊25°C，檢查雌蛘外鰓絲狀態；當外鰓絲完全膨脹并充滿兩側外套腔時，選出作為待孕雌蛘；
e、將選出的待孕雌蛘隨機分成兩組隔離培育，一組為自然受精組，另一組為人工授精組；自然受精組按雌雄性比為廣4 1加入隔離培育后的雄蛘，每天定時檢查自然受精組的待孕雌蛘外鰓絲，當累計有80%的雌蛘受精，提示開始進行人工授精組雄蛘的催產；
f、取出隔離培育的雄蛘，斧足肌肉注射5-羥色胺，注射劑量為4、微克/克雄蛘濕重； 注射后雄蛘離水，室溫平放1(Γ30分鐘，觀察雄蛘出水口的分泌物，取每個雄蛘的分泌物， 顯微鏡下檢查每個雄蛘的分泌物內是否有精子，當該雄蛘的分泌物內的精子有50%以上數量精子成熟并做快速運動時，該雄蛘及分泌物用于人工授精；
g、將用于人工授精的雄蛘及分泌物立即移入人工授精組的待孕雌蛘培育池中，用于人工授精的雄蛘數量與待孕雌蛘雌數量的比為廣4 :1，培育池內暫停流動水，采用氣泵增氧， 使得培育池中溶氧達到5、毫克/升，雄蛘移入人工授精組的待孕雌蛘培育池1(Γ30分鐘， 人工授精完成。本發明的方法與已有技術相比具有以下優點
1、采用微流水培育技術，使雌蛘、雄蛘性腺快速完全發育；通過雌雄親本隔離培育，防止自然受精的發生，并使雌雄親本性腺發育同步，為提高人工授精的成功率奠定了基礎；
2、以自然受精組作為對照，通過檢查待孕雌蛘累計受精比例，精確確定雄蛘的人工催產時間，提高了雄蛘催產效率及成熟精子比例；
3、通過斧足肌肉注射5-羥色胺，促進雄蛘排精；注射后采用離水排精方式，避免精子大量排到水中后對雌蛘排卵誘導效率下降，提高了成熟精子的利用率；人工注射催產也避免了直接解剖取精對實驗動物的傷害，同時縮短了人工授精的持續時間，實現了三角帆蛘受精過程的人工調控。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
4
實施例1
1、2010年3月10日，從江蘇太湖貢湖段采集三角帆蛘親本1200只，從中挑選出4飛齡親本，且貝殼完整無損、噴水有力、體質健康的個體290只，通過觀察鰓絲間隔區分雌雄，選出雌蛘157只，雄蛘133只。2、用刻字機在選出的雌雄親本貝殼表面以阿拉伯數字及字母標記后，分別放入小型培育池中強化培育，每個培育池的面積為2. 5平方米，雌蛘、雄蛘的放養密度均為8只/ 平方米，每個培育池的高度25厘米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作為水源保持培育池內為流動水，培育池內流動水的流速控制在0. 5米/分鐘。3、隔離流水培育至2010年5月10日，近5日平均水溫19. 5°C，檢查雌蛘外鰓絲， 發現78只雌蛘外鰓絲達到完全膨脹飽滿狀態，選出作為待孕雌蛘。4、2010年5月10日，將78只待孕雌蛘隨機平均分成2大組。一組為自然受精組，另一組為人工授精組；自然受精組按雌雄性比3 :1比例加入隔離培育的雄蛘；每天上午 10:00檢查自然受精組的待孕雌蛘外鰓絲，至5月16日累計有32只(共計84. 6%)的雌蛘受精，提示可以開始人工授精組雄蛘的催產。5、2010年5月16日，10 :40取隔離培育的雄蛘30只，斧足肌肉注射5_羥色胺，劑量為5微克/克雄蛘濕重；注射后離水，室溫平放30分鐘后；觀察出水口的分泌物，取分泌物鏡檢，其中有21只出現排精現象，14只雄蛘的分泌物中精子質量較好，達到50%以上快速運動標準，取13只雄蛘及分泌物準備用于人工授精。6、將準備用于人工授精的13排精雄蛘及分泌物立即移入人工授精組待孕雌蛘培育池中，雌雄性比3 :1 ；暫停培育池內的流動水，采用氣泵增氧，使得培育池中溶氧達到5毫克/升；10分鐘后檢查待孕雌蛘外鰓絲，觀只排卵受精，人工受精比例達71. 8%。實施例2
1、2010年3月10日，從江蘇太湖貢湖段采集三角帆蛘親本1200只，從中挑選出4 6 齡親本，且貝殼完整無損、噴水有力、體質健康的個體290只，通過觀察鰓絲間隔區分雌雄， 選出雌蛘157只，雄蛘133只。2、用刻字機在選出的雌雄親本貝殼表面以阿拉伯數字及字母標記后，分別放入小型培育池中強化培育，雌蛘、雄蛘的放養密度均為10只/平方米，每個培育池的高度25厘米，每個培育池的水位為10厘米，每個培育池的面積為2. 5平方米，利用高位池自流水作為水源保持培育池內為流動水，培育池內流動水的流速控制在1. 5米/分鐘。3、隔離流水培育至2010年5月25日，近5日平均水溫20. 8°C，檢查雌蛘外鰓絲， 發現80只雌蛘外鰓絲達到完全膨脹飽滿，選出作為待孕雌蛘。4、2010年5月25日，將80只待孕雌蛘隨機平均分成2大組，一組為自然受精組， 另一組為人工授精組；自然受精組按雌雄性比4 1比例加入隔離培育的雄蛘，用于自然受精的雄蛘共有10只；每天上午10 00檢查自然受精組的待孕雌蛘外鰓絲，至5月27日累計有37只(共計92. 5%)雌蛘已受精，提示可以開始人工授精雄蛘的催產。5、2010年5月27日，11 :00取隔離培育的雄蛘40只，斧足肌肉注射5_羥色胺，劑量為9微克/克雄蛘濕重；注射后離水，室溫平放30分鐘后，取出水口分泌物鏡檢，其中有 35只催產雄蛘出現排精，20只精子活力好，達到50%以上快速運動標準，取10只雄蛘及分泌物準備用于人工授精。
6、將用于人工授精的10只排精雄蛘及分泌物立即移入待孕雌蛘培育池中，雌雄性比為4 :1 ；暫停培育池內的流動水，采用氣泵增氧，使得培育池中溶氧達到6毫克/升；20 分鐘后檢查待孕雌蛘外鰓絲，35只排卵受精，人工受精比例達87. 5%。實施例3
1、2011年3月15日，從中國水產科學研究院淡水漁業研究中心江陰實驗基地太湖三角帆蛘親本池塘，挑選出貝殼完整無損、噴水有力、體質健康的個體255只，根據2010年的貝殼表面標記，其中雌蛘138只，雄蛘117只。2、將選出的雌雄親本分別放入小型培育池中強化培育，雌蛘、雄蛘的放養密度均為5只/平方米，每個培育池的高度25厘米，每個培育池的水位15厘米，每個培育池的面積為2. 5平方米，利用高位池自流水作為水源保持培育池內為流動水，培育池內流動水的3 米/分鐘。3、隔離流水培育至2010年5月26日，近5日平均水溫21. 5°C，檢查雌蛘外鰓絲， 發現102只雌蛘外鰓絲完全膨脹飽滿，選出作為待孕雌蛘。4,2009年5月沈日，將102只待孕雌蛘隨機平均分成2大組，一組為自然受精組， 另一組為人工授精組；自然受精組按雌雄性比1:1增加隔離培育的雄蛘，用于自然受精的雄蛘共有51只；在同等條件下流水培育。每天上午10 00檢查自然受精組的待孕雌蛘外鰓絲，至5月觀日累計有45只(共計88. 2%)雌蛘已受精，提示可以開始人工授精組雄蛘的催產。5、5月觀日，11 :00取隔離培育的雄蛘70只，斧足肌肉注射5-羥色胺，劑量為4 微克/克雄蛘濕重；注射后離水，室溫平放30分鐘后，觀察出水口的分泌物，取分泌物鏡檢， 有60只雄蛘出現排精現象，51只雄蛘的精子質量較好，達到50%以上快速運動標準，該51 只雄蛘及分泌物準備全部用于人工授精。6、將用于人工授精的51只雄蛘及分泌物立即移入待孕雌蛘培育池中，雌雄性比 1 1 ；暫停培育池內的流動水，采用氣泵增氧，使得培育池中溶氧達到8毫克/升；30分鐘后檢查待孕雌蛘外鰓絲，42只排卵受精，人工授精比例達82. 4%。本發明的方法實現了三角帆蛘受精過程的人工調控，在1(Γ30分鐘，三角帆蛘人工授精率可達709Γ90%，為開展三角帆蛘多倍體育種、家系選育等研究創造了基本條件。
權利要求
1. 一種三角帆蛘人工催產及授精的方法，其特征是該方法包括以下步驟a、選取貝殼完整無損、噴水有力、健康的三角帆蛘4飛齡親本并鑒別其性別；b、在鑒別完雌雄性別的親本的貝殼表面進行標記，并記錄標記后親本個體相關信息； C、將標記后的親本按照雌雄性別隔離進行培育池放養培育，放養密度均為5 10只/平方米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作為水源保持培育池內為流動水， 培育池內流動水的流速控制在0. 5^3米/分鐘；d、親本隔離培育至5月中旬，當近5日平均水溫達1纊25°C，檢查雌蛘外鰓絲狀態；當外鰓絲完全膨脹并充滿兩側外套腔時，選出作為待孕雌蛘；e、將選出的待孕雌蛘隨機分成兩組隔離培育，一組為自然受精組，另一組為人工授精組；自然受精組按雌雄性比為廣4 1加入隔離培育后的雄蛘，每天定時檢查自然受精組的待孕雌蛘外鰓絲，當累計有80%的雌蛘受精，提示開始進行人工授精組雄蛘的催產；f、取出隔離培育的雄蛘，斧足肌肉注射5-羥色胺，注射劑量為4、微克/克雄蛘濕重； 注射后雄蛘離水，室溫平放1(Γ30分鐘，觀察雄蛘出水口的分泌物，取每個雄蛘的分泌物， 顯微鏡下檢查每個雄蛘的分泌物內是否有精子，當該雄蛘的分泌物內的精子有50%以上數量精子成熟并做快速運動時，該雄蛘及分泌物用于人工授精；g、將用于人工授精的雄蛘及分泌物立即移入人工授精組的待孕雌蛘培育池中，用于人工授精的雄蛘數量與待孕雌蛘雌數量的比為廣4 :1，培育池內暫停流動水，采用氣泵增氧， 使得培育池中溶氧達到5、毫克/升，用于人工授精的雄蛘的分泌物移入人工授精組的待孕雌蛘培育池1(Γ30分鐘，人工授精完成。
全文摘要
本發明公開了一種三角帆蚌人工催產及授精的方法，該方法包括選擇4~6齡親本并鑒別性別、雌雄隔離培育池微流水同步培育、選出待孕雌蚌、待孕雌蚌分成自然授精組和人工授精組、雄蚌注射催產劑與人工授精各步驟。本發明的方法實現了三角帆蚌受精過程的人工調控，在10~30分鐘，三角帆蚌人工授精率可達70%~90%，為開展三角帆蚌多倍體育種、家系選育等研究創造了基本條件。
文檔編號A01K61/00GK102524134SQ20121003357
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者華丹, 周鑫, 徐鋼春, 聶志娟, 聞海波, 顧若波 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心