專(zhuān)利名稱(chēng)：一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOX11b及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因 PeffOXllb及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
楊樹(shù)是世界中緯度平原地區(qū)栽培最為廣泛的樹(shù)種之一，也是我國(guó)重要的速生工業(yè)用材樹(shù)種和綠化造林樹(shù)種之一，對(duì)我國(guó)無(wú)性系林業(yè)可持續(xù)發(fā)展發(fā)揮了重要作用。隨著速生高產(chǎn)楊樹(shù)新品種的不斷推廣，各地楊樹(shù)種植產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，目前我國(guó)楊樹(shù)人工林面積已超過(guò)700萬(wàn)公頃，居世界首位。一般而言，楊樹(shù)是適宜無(wú)性繁殖的樹(shù)種，在各種無(wú)性繁殖方法中，硬枝扦插最為普遍。插穗生根難易程度直接影響造林成活率，且事關(guān)無(wú)性系的適應(yīng)性和抗逆性。盡管大多數(shù)楊樹(shù)都比較容易扦插生根，然而仍有許多優(yōu)良無(wú)性系扦插生根困難。隨著林木遺傳改良工作和無(wú)性繁殖技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)于楊樹(shù)扦插繁殖的重要性有了新的認(rèn)識(shí)，意識(shí)到從理論和實(shí)踐上加強(qiáng)對(duì)扦插生根的機(jī)理研究有其必要性和迫切性?！案钊~茂”，兩者是相輔相成的。在擬南芥、水稻、玉米等草本植物中，根系分子生物學(xué)研究引起廣泛關(guān)注，并取得顯著進(jìn)展(Casson and Lindsey 2003 ；Hochholdinger and Zimmermann 2008 ；Peret et al. 2009)。然而,長(zhǎng)期以來(lái),楊樹(shù)遺傳改良研究更多的是集中在地上部分的表型性狀，而對(duì)根系發(fā)育性狀的缺乏研究，迄今鮮有楊樹(shù)扦插生根及其根系發(fā)育相關(guān)基因克隆及其功能研究的報(bào)道。楊樹(shù)扦插生根性狀屬于多基因控制的數(shù)量性狀， 受較強(qiáng)的遺傳控制(Zalesn y et al. 2005 ；Zhang et al. 2009)?？寺】刂七@些重要性狀的主效基因是林木后基因組時(shí)代的主要研究?jī)?nèi)容，不僅在探索林木根系發(fā)育生物學(xué)發(fā)面有重要的理論意義，而且在無(wú)性系林業(yè)生產(chǎn)上有潛在應(yīng)用價(jià)值。WUSCHEL-related homeobox(WOX)蛋白是同源異型盒蛋白家族中為植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物胚胎發(fā)育、干細(xì)胞維持、器官發(fā)生及形態(tài)建成等過(guò)程中起著非常重要的作用(Deveauxet al. 2008 ；van der Graaffet al. 2009 ；Zhang et al. 2010)。擬南芥有 15個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子成員，分屬3個(gè)進(jìn)化分枝WUS分枝(WUS clade)包括AtWUS,AtWOXI-7 ； 中間分枝(intermediate cl ade)包括 AtW0X8,9,11,12 ;古老分枝(ancient clade)包括 AtffOXlO,13，14。AtWUS基因是植物WOX家族的創(chuàng)始成員，它的克隆代表著同源異型盒超基因家族一個(gè)新亞類(lèi)的發(fā)現(xiàn)(Lauxet al. 1996 ；Mayer et al. 1998 ；Haeckeret al. 2004)。AtWUS 基因的編碼產(chǎn)物是維持干細(xì)胞數(shù)量的內(nèi)源性信號(hào)分子，促進(jìn)花藥和胚珠發(fā)育(Ikeda et al. 2009)。AtffOXl和PRESSED FLOffERl (PRSl/Atff0X3)基因作用在于從各分生組織細(xì)胞層招募創(chuàng)始細(xì)胞以形成營(yíng)養(yǎng)器官和花器官(Shimizu et al. 2009 ；Vandenbussche et al. 2009)。AtW0X2、Atff0X8和AtW0X9基因在擬南芥胚胎發(fā)育過(guò)程中決定器官的特異性 (Breuningeret al. 2008 ；Palovaaraet al. 2010)。AtW0X2 和 AtW0X8 最初在卵細(xì)胞和合子中特異表達(dá)，隨后分別在合子第一次分裂產(chǎn)生的基細(xì)胞和頂細(xì)胞的子細(xì)胞中表達(dá);AtW0X9 最初在合子第一次分裂產(chǎn)生的基細(xì)胞的子細(xì)胞中表達(dá)。AtW0X4基因在原形成層和維管形成層中特異表達(dá)，在次生生長(zhǎng)過(guò)程中維持維管分生組織結(jié)構(gòu)(Jiet al. 2010 ；Hirakawaet al. 2010) ο AtW0X5在根尖不活動(dòng)中心特異表達(dá)(Haecke r et al. 2004)，然而AtW0X5和 AtWUS在維持根尖和莖尖干細(xì)胞中的作用是可以互相替代的(Sarkaret al. 2007) oAtff0X6/ PRETTY FEWSEEDS2 (PFS2)基因表達(dá)是胚珠正常發(fā)育所必需的，主要作用是在胚珠的形成中阻止細(xì)胞過(guò)早的分化(Park et al. 2005)。OsWOXlI是AtWOXll的同源基因，受控于生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素共同作用，主要在水稻不定根根原基及成熟初生根的分生組織中表達(dá)(Zhao et al. 2009)。AtW0X13在雄蕊、初生根、側(cè)根及胚胎發(fā)育過(guò)程中大量表達(dá)，而AtWOXH基因局限于側(cè)根形成早期和花藥中表達(dá)(Deveauxet al. 2008)。上述結(jié)果表明高等植物WOX基因家族的表達(dá)都具有時(shí)空特異性，可能都以不同的作用機(jī)制參與植物頂端發(fā)育調(diào)控。它們與相關(guān)基因及植物激素之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不十分清楚，在楊樹(shù)中尚未有WOX基因家族功能研究的相關(guān)報(bào)道。不定根發(fā)生既是植物器官發(fā)生和形態(tài)建成中最為基本的理論問(wèn)題，又是植物無(wú)性繁殖和離體器官再生方面重要的實(shí)踐問(wèn)題，因此成為近年來(lái)植物功能基因組研究的一個(gè)熱點(diǎn)。WOX基因家族在根尖干細(xì)胞維持、不定根根原基啟動(dòng)等過(guò)程中起著非常重要的作用，在楊樹(shù)中克隆和開(kāi)發(fā)利用這些基因資源，不僅有助于闡明植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，而且還能促進(jìn)林業(yè)優(yōu)良品系的快速繁殖，對(duì)農(nóng)、林與園藝業(yè)的發(fā)展具有不可估量的價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb。本發(fā)明的另一目的是提供一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb 的應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。含有權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的載體。含有權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的宿主細(xì)胞。楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb在調(diào)控楊樹(shù)不定根的發(fā)生和發(fā)育中的應(yīng)用。楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ N02所示。本發(fā)明以南林895楊初生不定根為材料，通過(guò)RACE技術(shù)克隆了 PeWOXllb基因。 同時(shí)，采用通路克隆技術(shù)構(gòu)建其楊樹(shù)過(guò)量表達(dá)載體pH35GS-PeW0Xllb，該基因位于啟動(dòng)子 P35S之后，在啟動(dòng)子P35S的驅(qū)動(dòng)下，PeffOXllb可在楊樹(shù)體內(nèi)高效表達(dá)，從而調(diào)控不定根的發(fā)生和發(fā)育。其中，所PeWOXllb基因是楊樹(shù)不定根發(fā)生發(fā)育關(guān)鍵基因。所述載體質(zhì)粒，在PeWOXllb基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S，它能使 PeffOXlIb基因在楊樹(shù)體內(nèi)聞效表達(dá)。所述載體質(zhì)粒，在PeWOXllb基因的3’端組裝了強(qiáng)終止子N0S，可有效終止 PeTOXllb基因的轉(zhuǎn)錄。所述載體質(zhì)粒組裝HPT基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的篩選。所述載體質(zhì)粒組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的PeWOXllb基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹(shù)受體細(xì)胞染色體中。
有益效果本發(fā)明通過(guò)將PeWOXl Ib基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)，過(guò)量表達(dá)PeWOXl Ib基因的轉(zhuǎn)基因楊不定根數(shù)目增多，莖上有不定根產(chǎn)生，而且在異位根上還能再生出新植株，說(shuō)明 PeWOXllb基因是控制楊樹(shù)不定根發(fā)生發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在林木基因工程和無(wú)性系林業(yè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。
圖I是植物表達(dá)載體pH5GS的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊半定量檢測(cè)I %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊的整體形態(tài)比較圖；圖中，左邊為未轉(zhuǎn)基因楊，右邊為轉(zhuǎn)基因楊；圖4是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊與未轉(zhuǎn)基因楊的根形態(tài)比較圖；圖中， 左邊未轉(zhuǎn)基因楊，右邊為轉(zhuǎn)基因楊；圖5是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊繼代培養(yǎng)苗10周后莖上產(chǎn)生異位根圖；圖6是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊繼代培養(yǎng)苗10周后葉尖產(chǎn)生異位根圖；圖7是過(guò)量表達(dá)PeWOXllb基因的轉(zhuǎn)基因楊繼代培養(yǎng)苗莖上異位根再生出新植株圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例所使用的主要試劑盒和藥品為RNAplant Reagent (TIANGEN)， RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), SuperScript First-Strand Synthesis Syste m (Invitrogen), LR Clonase 11 enzyme Mix (Invitrogen), pCR 8/Gff/TOPO vector (Invitrogen), TaKaRa LA Taq(TaKaRa), TaKaRa Taq(TaKaRa),p MD-19T(TaKaRa), 5，-Full RACE Kit (TaKaRa)，3’-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa)，所有引物合成及測(cè)序工作均由Irwitrogen(上海)完成。其他未作出說(shuō)明的均為常規(guī)要求。實(shí)施例1895楊cDNA模板的準(zhǔn)備可按常規(guī)方法準(zhǔn)備895楊cDNA，也可以采用如下方法準(zhǔn)備總RNA的粗提吸取ImL RNAplant Reagent裂解液于2mL離心管中，將適量經(jīng)液氮研磨精細(xì)的南林895楊根材料加入其中，渦旋并充分混勻；室溫水平放置離心管5-10min， 徹底裂解核蛋白；4°C 12000rmp離心2_5min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管；加入O. 2mL 5M NaCl,輕輕混勻；再加入O. 3mL氯仿,上下顛倒混勻；4°C 12000rmp離心IOmin,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管；重復(fù)氯仿抽提；加與所得上清液等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置IOmin ； 4 °C 12000rmp離心IOmin,棄上清液；加入O. 5mL新鮮配置的RLT buffer (ImL RLT加 10 μ L β -巰基乙醇)，徹底渦旋；加入250 μ L無(wú)水乙醇，吹打混勻；將混合液轉(zhuǎn)移至收集柱RNeasy mini column (Pink)中，12000rmp離心15s,棄濾液,離心管可重復(fù)使用；在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 離心 15s,棄濾液和離心管； 將新鮮配置的80 μ L DNase I incubation mix加入收集柱RNeasy mini colum膜中央，室溫靜置 15min ;在收集柱 RNeasy mini column 中加入 350 μ L RffI buffer, 12000rmp 離心 15s,棄濾液和離心管；將收集柱RNeasy mini column放入新的離心管,加500 μ L buffer RPE, 12000rmp 離心 15s,棄濾液；重新加入 500 μ L buffer RPE, 12000rmp 離心 2min,棄濾液和離心管；將收集柱RNeasy mini column放入新的離心管，13000rmp離心Imi η ;將收集柱RNeasy mini column放入新的RNA收集離心管,加入適量RNase-free water到膜中央， 靜置lmin, 12000rmp離心Imin ;將濾液重新加入收集柱RNeasy mini column, 12000rmp離心lmin，回收濾液，即得總RNA ;用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)確定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA的完整性，確認(rèn)質(zhì)量完好?？俁NA的純化將總RNA的體積用RNase-free水調(diào)整到100 μ L(確保RNA總量不超過(guò)100 μ g);加入350 μ L RLT工作液(ImL RLT力卩10 μ Li3 -巰基乙醇)，充分混勻； 加入250 μ L無(wú)水乙醇，充分混勻(不要離心)；將700 μ L混合液將到QIAGEN純化柱中， 12000rmp,離心15s ;棄濾液,加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份無(wú)水乙醇混勻而成), 12000rmp,離心15s ;棄濾液,重新加入500 μ L工作液(一份RPE加入4份無(wú)水乙醇混勻而成),12000rmp,離心2min ;將純化柱放入新的離心管,最大轉(zhuǎn)速離心Imin ;將純化柱重新放入新的RNA收集離心管，在純化柱膜中央加適量RNase-free水，室溫靜置Imin，最大轉(zhuǎn)速離心Imin ;回收濾液即得純化RNA樣品；第一鏈cDNA 合成米用 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (I nvitrogen),以O(shè)ligo DT-Adaptor Primer引物引發(fā)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。具體操作如下準(zhǔn)備RNA/Primer 混合液1 μ g 南林 895 楊 Total RNA, IyL Oligo DT-Ada ptor Primer (50ng/ μ L) , I μ L IOmM dNTP mix,加 DEPC-treated water 到 10 μ L ; 65°C溫浴5min,而后迅速放置冰上至少I(mǎi)min ;配制反轉(zhuǎn)錄混合液，依次加入試劑2 μ L 10XRT buffer,4y L 250nnM MgCl2、2yL 0. IM DTTU μ L RNase OUT (40U/μ L)、I μ L superscript RT (200U/ μ L);將 IOyL 反轉(zhuǎn)錄混合液加入 IOyL RNA/Primer 混合液中， 輕輕混勻，短暫離心；進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄程序25V, IOmin, 50°C, 50min, 85°C, 5min (終止反應(yīng))， 然后置于冰上；加IuL RNase H，混勻，短暫離心，37°C溫浴20min ;冰上冷卻后使用滅菌 Milli-Q水I : 50稀釋后( 10ng/yL)-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2通過(guò)RACE技術(shù)克隆PeWOXl Ia基因以實(shí)施例I制備的895楊cDNA為模板，使用特異性引物來(lái)擴(kuò)增PeWOXllb基因短片段，其中，擴(kuò)增PeWOXllb短片段正向引物為5’AACGCCAGATGCAAGCTAGT 3 ;擴(kuò)增PeWOXllb 短片段反向引物為5’TCTGTTGGAACCCCATTGAT 3，。高保真PCR反應(yīng)體系如下10 X LA PCR Buffer (Mg2+ free) 5. O μ L ；2. 5mM dNTP Mixture 8. 0 μ L ；25mM Mg2+ 5. 0 μ L ；LA Taq DNA Poly merase (5U/μ L) 0. 5 μ L ;正向引物(10μΜ)2μ L ;反向引物(10μΜ)2μ L ;模板(895 楊 cDNA) I μ L ;加無(wú)菌 ddH20 補(bǔ)足 50 μ L0 反應(yīng)程序預(yù)變性 94°C，3min ;94°C，40s，55°C， 30s，72°C，30s，35個(gè)循環(huán)；72°C，10min。對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，獲得的PeWOXlla基因短片段序列如 SEQ N03 所示。依據(jù)上述PeWOXlla基因短片段序列設(shè)計(jì)3’末端的RACE引物，進(jìn)行3’ RACE，獲得3’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對(duì)插入片段進(jìn)行PCR篩選后進(jìn)行測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast, ncbi. nlm. nih. rov/)中Blast確認(rèn)上述片段與其它植物相關(guān)的基因同源。以相同的方法，根據(jù)獲得的正確的3’ cDNA末端片段序列設(shè)計(jì)5’末端的RACE引物，進(jìn)行5’ RACE，獲得5’ cDNA末端片段，克隆入T-載體，對(duì)插入片段進(jìn)行PCR篩選后進(jìn)行測(cè)序。 主要引物和過(guò)程如下3’ RACE 弓 I 物3 1 RACE gene-specific outer primer 5 ' ATAATCAACGGGCATACGATAGC 3 ； 3 ' RACE gene specific inner primer 5 ' CTTGTTTTCTTTCTCTAACCAGArGGGT 3，； 3 ' RACE Outer Primer 5' GCGAGCACAGAATTAATACGACT 33' RACE Inner Primer 5/ CGCGGATCCGAATTAATACGACT CACTATAGG 3，。3' RACE 反應(yīng)程序根據(jù)3，-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (TaKaRa) Protocol 進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription):將表I成分加入到一個(gè)置于冰上的 RNase-free的小離心管中，輕輕混勻，短暫離心，42°C溫育lh，72°C溫育15min ;進(jìn)入PCR步驟，或-20°C保存反應(yīng)物。表I反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXlIb，其核苷酸序列如SEQ NOl所示。
2.含有權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體在PeWOXllb基因的5’端組裝組成型強(qiáng)表達(dá)啟動(dòng)子P35S。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體在PeWOXllb基因的3’端組裝了強(qiáng)終止子NOS。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝HPT基因表達(dá)盒，作為轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的篩選標(biāo)記，可以用潮霉素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)的篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的載體，其特征在于所述載體組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的PeWOXllb基因表達(dá)框架和篩選標(biāo)記基因HPT整合至楊樹(shù)受體細(xì)胞染色體中。
7.含有權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的宿主細(xì)胞。
8.權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb在調(diào)控楊樹(shù)不定根的發(fā)生和發(fā)育中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述的楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOXllb的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如 SEQ N02 所示。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種楊樹(shù)不定根發(fā)育關(guān)鍵基因PeWOX11b，其核苷酸序列如SEQNO1所示。本發(fā)明通過(guò)將PeWOX11b基因轉(zhuǎn)入楊樹(shù)，過(guò)量表達(dá)PeWOX11b基因的轉(zhuǎn)基因楊不定根數(shù)目增多，莖上有不定根產(chǎn)生，而且在異位不定根上還能再生出新植株，說(shuō)明PeWOX11b基因是控制楊樹(shù)不定根發(fā)生發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在林木基因工程和無(wú)性系林業(yè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A01H5/06GK102586272SQ20121001773
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者徐立安, 潘惠新, 王光萍, 王明庥, 胥猛, 謝雯凡, 陳英, 黃敏仁 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)