專利名稱：一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種鮑的養殖活菌制劑，尤其是涉及一種主要用于鮑養殖的腸道益生菌粉及其制備方法。
背景技術：
我國鮑養殖始于20世紀70年代后期，目前已成為世界第一鮑魚養殖大國，年產值達40多億元，成為我國海水養殖產業的重要組成部分。然而，伴隨著養殖業的快速發展，集約化程度的提高以及沿海水質的日益惡化，鮑暴發性病害日益增多，特別是2000年以來， 以養成階段的季節轉換期暴發性死亡最為嚴重，在養鮑場密集的區域發病率高達90%以上，造成了慘重的經濟損失。同時抗生素濫用造成生物的抗藥性，并引發了一系列環境和社會問題，使一度蓬勃發展的鮑養殖業陷入低谷，已成為制約養殖業發展的重要因素之一。鮑腸道益生菌可以針對養殖鮑過程中常見的腸胃病、細菌滋擾、不明原因產生的死亡及零星死亡，替代因抗生素引起的應激反應，在促進鮑魚生長，防治病害方面發揮重要作用。且由于益生菌具有無毒、無殘留、不產生抗藥性等特點，對促進鮑健康養殖具有重要意義。益生菌是一類活菌制劑，通過與病原菌競爭化學物質和黏附位點，產生拈抗物質或提供宿主必要營養物質或酶，或調節并激活宿主免疫防御體系，或改善宿主腸道營養與菌群平衡從而對宿主產生有益的生理作用(Verschuere L et al, Microbiol Mol Biol Rev. 2000,64 :655-671)。目前，利用益生菌來調節動物腸道微生態平衡，恢復機體正常生理功能、防治病害、促進生長，已逐漸成為世界范圍內的熱潮。1986年，Kozasa等(Microbial Aliment Nutr, 1986,164 :351-358)首次利用芽抱桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺降低了由于感染愛德華氏菌而引起的死亡后，益生菌在水產研究方面得到迅速發展。但縱觀水產生物益生菌方面的研究報道，仍主要集中在魚類、甲殼類和雙殼類，而針對腹足類鮑的益生菌相對較少。目前，針對鮑養殖的益生菌及其制備存在以下幾個問題(I)多利用其它水生動物或水體中分離得到的益生菌應用于鮑養殖中，而微生物具有宿主特異性及環境易感性，因此缺乏針對性和穩定性而無法產生良好的效果。(2)篩選范圍有限，如集中在養殖環境，或直接應用已報道的海洋細菌等，使益生菌菌種較為單一，它們在完全替代抗生素的過程中抗菌抗病毒效果并不理想。(3)由于宿主消化道酸性環境的滅活及消化酶的降解作用，大部分益生菌不能以活菌狀態到達腸道，或在腸道粘膜上定植，發揮有效的益生作用。(4)目前，水產生物養殖用的活菌制劑多為膠囊或液體或菌體干粉形式，應用方式多直接投喂，或與飼料混合進行投喂。但存在鮑魚拒食、益生菌無法與飼料粘合不能進入宿主體內發揮作用、益生菌外流至水體，使微生物數量激增造成養殖環境污染等問題。
發明內容
本發明目的在于針對現有養殖鮑益生菌應用中存在的問題及不足，提供一種能夠有效、直接進入鮑腸道并發揮益生作用的用于鮑養殖的腸道益生菌粉。本發明的另一目的在于提供一種具有操作簡單、效果穩定、針對性強、不污染養殖環境等優點的用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法。所述用于鮑養殖的腸道益生菌粉按質量比的組成如下益生菌干粉瓊脂粉飼料為(0. I I) (I 20) (5 150)。所述飼料可選自鮑飼料，所述飼料可選自大統牌、金牌、洪峰牌等鮑用飼料。所述用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法包括以下步驟I)分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220和芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus A3440,經培養基活化后,接種于發酵培養基中，振蕩培養，使菌體濃度達到對數生長期0. 5 I. OX 109cfu/ml ；2)將各菌種發酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護劑；4)將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應，然后，將混合物預凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；5)將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養殖的腸道益生菌粉。在步驟I)中，所述海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5254 ;所述芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5253 ;所述培養基可采用2216E固體培養基等；所述發酵培養基可采用2216E液體發酵培養基等；所述振蕩培養的條件可為在28°C下振蕩培養 I 3天。在步驟2)中，所述洗滌可用生理鹽水洗滌2 3遍。在步驟3)中，所述干粉保護劑的組成按質量百分比可為蔗糖1.0% 10.0%，褐藻酸鈉0. 1% 5. 0%,加水定容至IOOml ;所述滅菌的條件可為115°C,30min滅菌后,冷卻至 30 35°C。在步驟4)中，所述干粉保護劑和菌泥的配比可為干粉保護劑菌泥=(I 10) ml lg，其中干粉保護劑按體積計算，菌泥按質量計算；所述成膜反應可將干粉保護劑和菌泥混合放置10 30min后再進行成膜反應；所述預凍的條件可為預凍于_70°C，3 4h。在步驟5)中，所述用于鮑養殖的腸道益生菌粉按質量比的組成如下益生菌干粉、瓊脂粉、飼料的質量比為(0. I I) (I 20) (5 150);所述飼料可選自鮑飼料， 所述飼料可選自大統牌、金牌、洪峰牌等鮑用飼料。使用時，將用于鮑養殖的腸道益生菌粉用水溶解，益生菌粉與水的比例可為5 30g 100ml，冷卻后凝固成膠體，即可。本發明的突出優點是I)選自鮑消化道分離的微生物作為腸道益生菌的來源，具有較高的針對性和穩定性，并能有效促進鮑的生長，與投喂常規飼料比較，鮑的生長率可提高19. 92% 25. 55%。2)與現有保護劑比較，本發明中的干粉保護劑(蔗糖與褐藻酸鈉)的添加能有效減少菌株在制備、運輸過程中數量減少，菌體流失等問題，與多種菌體保護劑相比的實驗結果見表I。表I不同保護劑下益生菌24h后活菌濃度
權利要求
1.一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉，其特征在于按質量比的組成如下益生菌干粉 瓊脂粉飼料為(O. I I) (I 20) (5 150)。
2.如權利要求I所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉，其特征在于所述飼料選自鮑飼料。
3.如權利要求I所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobactersp. AP1220和芽孢桿菌Bacillus stratosphericus A3440,經培養基活化后,接種于發酵培養基中，振蕩培養，使菌體濃度達到對數生長期O. 5 I. 0X109cfu/ml ；2)將各菌種發酵液混合后離心，棄上清，菌體沉淀洗滌，離心，滅菌，得菌泥；3)配制干粉保護劑；4)將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應，然后，將混合物預凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；5)將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養殖的腸道益生菌粉。
4.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述海洋細菌Phaeobacter sp. AP1220已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5254 ;所述芽抱桿菌Bacillus stratosphericus A3440已于2011年09月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號=CGMCC No. 5253。
5.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述培養基采用2216E固體培養基。
6.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述發酵培養基采用2216E液體發酵培養基；所述振蕩培養的條件可為在28°C下振蕩培養I 3天。
7.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述洗滌是用生理鹽水洗滌2 3遍。
8.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述干粉保護劑的組成按質量百分比為蔗糖1.0% 10.0%，褐藻酸鈉O. 1% 5.0%，加水定容至IOOml ;所述滅菌的條件可為115°C，30min滅菌后，冷卻至30 35°C。
9.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述干粉保護劑和菌泥的配比為干粉保護劑菌泥=(I 10)ml lg，其中干粉保護劑按體積計算，菌泥按質量計算；所述成膜反應可將干粉保護劑和菌泥混合放置10 30min后再進行成膜反應；所述預凍的條件可為預凍于_70°C，3 4h。
10.如權利要求3所述的一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述用于鮑養殖的腸道益生菌粉按質量比的組成如下益生菌干粉、瓊脂粉、飼料的質量比為(O. I I) (I 20) (5 150);所述飼料可選自鮑飼料。
全文摘要
一種用于鮑養殖的腸道益生菌粉及其制備方法，涉及一種鮑的養殖活菌制劑。腸道益生菌粉由益生菌干粉、瓊脂粉和飼料組成。分別將鮑腸道中分離的海洋細菌Phaeobacter sp.AP1220和芽孢桿菌Bacillus stratosphericus A3440，經培養基活化后接種于發酵培養基中振蕩培養，使菌體濃度達到對數生長期0.5～1.0×109cfu/ml；將各菌種發酵液混合后離心棄上清，菌體沉淀洗滌離心滅菌得菌泥；配制干粉保護劑；將干粉保護劑和菌泥混合，進行成膜反應，然后，將混合物預凍，再冷凍干燥，制成具有包埋層的活性益生菌干粉；將益生菌干粉、瓊脂粉和飼料混合，制成用于鮑養殖的腸道益生菌粉。
文檔編號A23K1/18GK102578402SQ20121001601
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者柯才煥, 蔣慶茹, 趙晶 申請人:廈門大學