專利名稱：一種楊樹單倍體培育方法
技術領域：
本發明涉及一種單倍體植物的培育方法，特別涉及一種采用植物組織培養獲得楊樹單倍體的培育方法，屬于楊樹單倍體的選育領域。
背景技術：
北京楊(Populus beijingensis)為青楊和鉆天楊的雜交后代，是新中國成立后林業界第一次用人工雜交育種方法育成的楊樹新品種，其具有耐寒、喜水肥、樹態美等特點， 是優良的用材林、防護林、行道樹和“四旁”綠化樹種，主要分布于中國的華北和西北等地區，深受群眾喜愛。楊屬植物是雌雄異株，自花授粉基本上是不可能實現的。通過常規的雜交育種獲得純合的株系需要很長的育種周期。為了獲得純合的楊樹株系，研究者以往采用自花授粉或是回交的方法，但是這一育種過程需要的育種年限很長。通過花藥培養則可以先獲得目標株系的單倍體，后將其進行加倍成為雙單倍體(doubled haploids, DHs)，這樣就明顯的縮短育種周期。此外，隨著現代生物分子技術的迅速發展，植物單倍體及其產物已經在倍性育種、基因組測序、圖譜構建和功能基因的發掘與鑒定等多方面成功應用并取得了很大的成果，單倍體植物材料及其產物為越來越多的研究者所青睞。目前，植物單倍體的誘導途徑包括花藥和花粉培養、孤雌生殖、染色體消除等，其中花藥培養是獲得植物單倍體的一種較為有效的技術。在離體條件下，用離體的方法培養花藥，人為的改變小孢子的發育途徑，使其配子體發育途徑終止，轉向孢子體發育，通過器官分化的途徑，獲得完整的單倍體植株，為人工大量生產單倍體提供了有效地手段。通過這一途徑再生的單倍體植株，經過自發加倍或人工誘導加倍，獲得純和二倍體植株，從而為進一步的育種和遺傳研究提供有用的材料。利用花藥花粉培養獲得單倍體進行育種是植物育種技術上的一項重大改革，它可以與目前所采用的雜交育種、人工誘變育種、遠緣雜交等方法結合，用以克服這些方法中的不足，也可以直接用此方法創造新的類型。但是，以楊樹花藥為外植體選育楊樹單倍體的培養過程中一直存在愈傷組織誘導率低、愈傷組織器官分化率低等問題，導致現有的楊樹單倍體的培育方法遠遠不能滿足研究和生產實踐的需求，亟待改進。
發明內容
本發明的主要目的是針對現有的楊樹單倍體的培育方法中所存在的不足，提供一種新的楊樹單倍體的培育方法，該方法的楊樹花藥愈傷組織誘導率高、愈傷組織的器官分化率和不定芽的生根率高，可以在較短時間內形成大量優良的楊樹單倍體試管苗，可進行規模化、工廠化生產。為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案一種楊樹單倍體的培育方法，包括1)將消毒處理后的楊樹花藥接種在愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得楊樹愈傷組織；2)將楊樹愈傷組織接種于不定芽分化培養基上進行不定芽的分化培養，獲得楊樹不定芽；3)將楊樹不定芽接種于生根培養基上進行生根培養，獲得試管小苗；4)經過倍性鑒定，獲得楊樹單倍體植株。其中，所述的楊樹優選為北京楊(Populus beijingensis)。為了達到更好的培育效果，當楊樹花序的小孢子發育時期處于單核靠邊期時，此時將其中的花藥取出進行愈傷組織的誘導培養，能有效的提高愈傷組織的誘導培養率；其中，楊樹小孢子發育時期可以通過觀察花芽的形態和直徑粗略判斷小孢子的發育時期。較為有效的檢測方法是染色觀察小孢子的發育階段，這些方法或手段均為本領域技術人員所通曉；本發明通過醋酸洋紅染色觀察來確定小孢子的發育時期。由于楊樹花為柔荑花序，花芽表面的鱗片微被氈毛，步驟1)中所述消毒處理采用如下處理方式具有更好的無菌效果1-A)用毛筆輕刷花芽鱗片表面后用無菌水沖洗花芽；1-B)用酒精浸泡花芽；1-C)用次氯酸鈉溶液對花芽進行表面滅菌，用無菌水沖洗；1-D)吸干花芽表面水分后從花序取出花藥，即得。優選地，步驟1-A)中無菌水沖洗次數為4-5次；步驟1-B)中所述酒精的體積百分比濃度為70. 0% ；浸泡時間為30s ；步驟1-C)中次氯酸鈉的質量百分比濃度為7. 0% ；表面滅菌時間為5min ；無菌水沖洗次數為3-5次。步驟1)中所述愈傷組織誘導培養基優選是H基本培養基+奈乙酸 (NAA)O. 5-1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤(KT)O. 5-1. Omg/L+蔗糖 30g/L+瓊脂 5. 5g/L ；更優選為 H基本培養基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 5g/L ；最優選為H基本培養基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5. 5g/ L ；進一步優選的，步驟1)中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為25 士 1°C ；步驟幻中所述不定芽分化培養基優選是MS培養基+6-芐基腺嘌呤(BAP)O. 6mg/ L+ 奈乙酸(NAA)0. 2mg/L+ 赤霉素(GA3)0. 02-0. 2mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L ；更優選為MS培養基+6-芐基腺嘌呤0. 6mg/L+奈乙酸0. 2mg/L+赤霉素0. 02mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 5g/L ；進一步優選的，步驟2、中所述不定芽分化培養在以下條件下進行培養溫度為 25士 1°C，光照1500 20001x，光照時間16小時/天；步驟3)中所述生根培養基優選是1/2MS培養基+吲哚丁酸(IBA)O. 2-0. 5mg/ L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 5g/L ；更優選為:1/2MS培養基+吲哚丁酸0. 3mg/L+蔗糖20g/L+ 瓊脂5. 5g/L ；進一步優選的，步驟幻中所述生根培養在以下條件下進行培養室溫度為 25士 1°C，光照1500 20001x，光照時間16小時/天。本發明楊樹單倍體培育方法利用楊樹花藥經過誘導愈傷組織后再器官分化為植株，從而獲得楊樹單倍體植株。為了提高培養過程中愈傷組織誘導率、愈傷組織器官分化率及生根率等問題，本發明對愈傷組織誘導培養基、不定芽器官分化培養劑以及生根培養基的配方進行了優化，最終篩選得到了不同培養階段的最適宜的培養基組成，顯著的提高了愈傷組織誘導率、愈傷組織器官分化率及生根率，最終提高了楊樹單倍體的得率，為楊樹的育種、品質改良、遺傳研究等提供了物質基礎。本發明方法培育的楊樹單倍體植株生長健壯、繁殖系數高，獲得試管小苗移栽成活率高達92.0%，是工廠化大規模生產北京楊植株的簡便、快捷的技術體系。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1一、試驗材料1、供試材料北京楊(Populus beijingensis)；2、植物生長調節劑本發明中所使用的植物生長調節物質采用國產萘乙酸(NAA)、6_芐氨基腺嘌呤 (BAP)、6-糠氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA3)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4_D)、吲哚丁酸(IBA)。3、培養基的配制(1) "MS基本培養基”的組成及配制方法表1 MS 培養基(Murashige and Skoog, 1962)
母液種類成分名稱濃度(mg/L)母液種類成分名稱濃度(mg/L)大量元素KNO338 000微量元素KI166(母液I)NH4NO333 000(母液II)H3BO31 240KH2PO43 400MnSO4-H2O4 460MgSO4 ·7Η207 400ZnS04 7H201 720CaCl2.2H208 800Na2MoO4^H2O50鐵鹽FeSO4CH2O5 560CUS04 5H205(母液ΠΙ)Na2-EDTA-2H207 460COC12.2H205有機成IVA肌醇20 000分IVB煙酸100IVB甘氨酸400(母液IV)維生素B1100維生素B6100 以上各種營養成分的用量，除了母液I為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。上述MS培養基母液配好后，儲存于4°C冰箱待用。根據配制培養基的總量，稱量所需的瓊脂和蔗糖，將其倒入欲配培養基體積3/4的蒸餾水中，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量，如需添加激素則根據培養基配方中激素的種類和濃度，將其與各種母液一起放入搪瓷量杯中。每加入一種都充分攪拌，最后加蒸餾水定容至總體積，攪拌均勻。用PH計測試培養基酸堿度，用滴管吸取1. Omol/L的NaOH溶液逐滴加入融化的培養基中，邊滴邊攪拌，直到培養基的pH值調整至 5. 8。(2) H基本培養基”的組成及配制方法表2 H培養基
權利要求
1.一種楊樹單倍體培育方法，包括如下順序進行的步驟1)將消毒處理后的楊樹花藥接種在愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得楊樹愈傷組織；2)將楊樹愈傷組織接種于不定芽分化培養基上進行不定芽的分化培養，獲得楊樹不定芽；3)將楊樹不定芽接種于生根培養基上進行生根培養，獲得試管小苗；4)經過倍性鑒定，獲得楊樹單倍體植株。
2.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征在于所述的楊樹是北京楊(Populus beijingensis)。
3.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征在于所述楊樹花藥是發育時期為小孢子處于單核靠邊期的楊樹花藥。
4.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟1)中所述愈傷組織誘導培養基是=H基本培養基+奈乙酸0. 5-1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 5. 5g/L ；優選為=H基本培養基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5-1. Omg/L+蔗糖30g/ L+瓊脂5. 5g/L ；更優選為H基本培養基+奈乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤1. Omg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 5. 5g/L。
5.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟1)中所述愈傷組織誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為25士 1°C。
6.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟幻中所述不定芽分化培養基是 MS培養基+6-芐基腺嘌呤0. 6mg/L+奈乙酸0. 2mg/L+赤霉素0. 02-0. 2mg/L+蔗糖20g/L+ 瓊脂5. 5g/L ；優選為MS培養基+6-芐基腺嘌呤0. 6mg/L+奈乙酸0. ang/L+赤霉素0. 02mg/ L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L。
7.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟幻中所述不定芽分化培養在以下條件下進行培養溫度為25士 1°C，光照1500 20001x，光照時間16小時/天。
8.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟幻中所述生根培養基是1/2MS 培養基+吲哚丁酸0. 2-0. 5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5. 5g/L ；優選為1/2MS培養基+吲哚丁酸 0. 3mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 瓊脂 5. 5g/L。
9.如權利要求1或2所述的楊樹培育方法，其特征是步驟4)中所述生根培養在以下條件下進行培養溫度為25士 1°C，光照1500 20001x，光照時間16小時/天。
10.如權利要求1所述的楊樹培育方法，其特征是步驟1)中所述消毒處理包括如下步驟1-A)用毛筆輕刷花芽鱗片表面后用無菌水沖洗花芽； 1-B)用酒精浸泡花芽；1-C)用次氯酸鈉溶液對花芽進行表面滅菌，用無菌水沖洗； 1-D)吸干花芽表面水分后從花序取出花藥，即得。
全文摘要
本發明公開了一種楊樹單倍體的培育方法，屬于楊樹單倍體的選育領域。所述培育方法包括1)將消毒處理后的楊樹花藥接種在愈傷組織誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，獲得楊樹愈傷組織；2)將愈傷組織接種于不定芽分化培養基上進行不定芽的分化培養，獲得楊樹不定芽；3)將不定芽接種于生根培養基上進行生根培養，獲得試管小苗；4)經過倍性鑒定，獲得楊樹單倍體植株。本發明楊樹單倍體的培育方法解決了楊樹單倍體培育中所存在的問題，愈傷組織誘導率高，愈傷組織器官分化率高，繁殖率高，誘導繁殖操作步驟簡單，可以在短期內形成大量優良的楊樹試管苗，可進行規模化、工廠化生產，為楊樹的育種、品質改良、遺傳研究等提供了物質基礎。
文檔編號A01H4/00GK102550405SQ20111044033
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者安新民, 李英 申請人:北京林業大學